Méthodes d'étude des variations du génome 1 Flashcards
Quels sont les outils de base des méthodes d’étude des variations du génome ?
- l’hybridation
- les enzymes de restriction
Qu’est-ce que l’hybridation et sur quoi est-elle basée ?
C’est une propriété fondamentale des acides nucléiques simple brin à s’apparier ou s’hybrider avec un brin anti-sens pour former une molécule double brin et basée sur la complémentarité des bases G-C et A-T
Que permet de savoir l’utilisation de l’hybridation ?
D’obtenir une information (présence, taille) sur une séquence cible au sein d’une population complexe de molécules d’ADN d’une cellule ou d’un extrait biologique
Comment se fait cette étude ?
Par détection par une molécule complémentaire à la séquence cible appelée sonde (radioactive, fluorescente)
Quelles sont les caractéristiques de la dénaturation ? (et causes)
Réversible et causée par la chaleur, le pH, les solvants organiques
Qu’est-ce que Tm ?
C’est la température de fusion, le point d’inflexion de la courbe indiquant que 50% des paires de bases ont été séparées
Pourquoi l’absorbance augmente-t-elle avec le degré de dénaturation ?
Parce que les bases sont de plus en plus exposées qui sont donc capables d’absorber
Quelle est la particularité des chaines avec beaucoup de paires GC ?
Elles ont besoins de plus d’énergie pour les déshybrider
A quelle longueur d’onde nous fixons-nous pour mesurer l’absorbance de la molécule d’ADN ?
260 nm
Quels facteurs influencent l’hybridation ?
La température, la force ionique : la notion de stringence
Quelles hybridations sont-elles possibles ?
Des homoduplexes et hétéroduplexes donc la complémentarité pas toujours complète
Que permettent les enzymes de restriction ?
Elles permettent la fragmentation de l’ADN double brin sur les sites de restriction
Quelles sont les caractéristiques des coupures des enzymes de restriction ?
Coupure spécifique et reproductible (à l’identique)
Qu’est-ce que les sites de restriction ?
Des séquences de 4 à 6 nucléotides, palindromiques (identiques sur les 2 brins dans la lecture 5’ > 3’) sensibles ou non à la méthylation
Qu’est-ce que les isoschizomères ?
Ce sont deux enzymes de restriction reconnaissant le même site
Quel est le lien avec la taille du site de restriction, la fréquence du site et la taille moyenne des fragments ?
La fréquence du site de restriction diminue lorsque la taille du site de restriction augmente induisant l’augmentation de la taille moyenne des fragments
Quels sont les différents types de coupure de l’enzyme de restriction ?
- la coupure franche
- l’autre où la coupe induit des fragments simple brin, des extrémités libres, cohésives
Qu’est-ce que la méthode southern blot ?
C’est une analyse qualitative et semi-quantitative de séquences d’ADN génomique mettant en évidence des grands remaniements (grandes délétions, grandes insertions)
Quelles sont les étapes du Southern Blot ?
Digestion enzymatique pour fragmentation, et dénaturation pour déshybridation
Hybridation pour identifier la séquence et la comparer la taille avec d’autres d’individus sains ou malades pour mettre en évidence des grands remaniements (de paires de bases)
Qu’est-ce que le Northern blot ?
C’est la détection de molécules d’ARN spécifiques dans un mélange d’ARN à partir de tissus ou de cellules
Quelles sont les étapes du Northern Blot ?
- purification des ARN totaux ou ARN polyA+ (ARNm)
- séparation par électrophorèse en fonction de la taille : conditions dénaturantes
- destruction des structures secondaires
Que permet le northern blot ?
L’analyse qualitative (taille, nature en fonction du stade de développement, spécificité tissulaire…) et semi-quantitative des ARN
Que permet la PCR ?
Il permet l’obtention en grande quantités d’une séquence cible délimitée par un couple d’amorces spécifiques de l’ADN d’intérêt
Quelles sont les étapes de la PCR ?
1) dénaturation (95°C)
2) hybridation des amorces (50-60°C)
3) extension (ou élongation) par l’ADN polymérase (72°C)
Quelles sont les caractéristiques de la PCR ?
- réaction enzymatique en chaine
- spécifique
- exponentielle 2^n (avec n le nombre de cycles)
Quelle est le contenu de départ d’une PCR ?
- une matrice d’ADN
- des dNTPs saturants
- des polymérases saturants
- des amorces saturantes
A quoi est liée la spécificité de la réaction ?
Elle est liée aux amorces : une amorce s’hybride sur le brin sens alors que l’autre amorce sur le brin anti-sens
Quel est l’autre nom des produits PCR ?
Les amplicons
Qu’est-ce que le séquençage du génome ?
C’est une technique basée sur la méthode de Sanger
Que permet la technique de Sanger ?
Elle permet de déterminer l’ordre d’enchaînement des nucléotides d’une séquence d’ADN
A partir de quoi est réalisée la technique de Sanger ?
A partir d’un fragment d’ADN qui servira de brin matrice pour la synthèse du brin complémentaire : obtention du brin matrice par PCR (ou clonage)
Quelle est la taille des fragments séquencés ?
Environ 500pb et < 1000 pb
Comment se fait la technique de Sanger ?
- incorporation aléatoire de ddNTPs (radioactifs, fluorescents) provoquant l’arrêt de l’élongation et permettant le marquage de l’extrémité 3’ du brin d’ADN en cours de synthèse
- le marquage de l’extrémité du fragment synthétisé par le ddNTP permet d’identifier le nucléotide
- lecture de la séquence correspondant en réalité à la lecture du dernier nucléotide incorporé
- reconstitution de la séquence après électrophorèse des fragments synthétisés en fonction de leur taille
Comment se fait la lecture de la séquence : chromatogramme restitué par l’électrophorèse capillaire dans séquenceur automatique ?
Comment sont déterminées les différentes mutations (hétérozygote ou homozygote) dans un chromatogramme ?
Qu’est-ce que la RT PCR ?
C’est une technique qui permet de faire une PCR à partir d’un échantillon d’ARN
Qu’est-ce que la transcriptase inverse ?
C’est une enzyme avec des amorces aléatoires ou spécifiques pouvant former de l’ADNc grâce à de l’ARN
Quelles sont les applications de l’obtention de l’ADNc ?
En vue de :
- RT PCR en temps réel
- Séquençage
- Clonage dans des vecteurs d’expression
Qu’est-ce que RFLP PCR ?
C’est une méthode d’analyse génétique permettant de détecter des mutations
Quelles sont les étapes de la PCR RFLP ?
Il y a tout d’abord amplification de la séquence et ensuite il y a digestion enzymatique avec une enzyme de restriction
Que se passe-t-il quand c’est une mutation qui abolit un site de restriction ?
- les 2 allèles seront clivés si il n’était pas muté
- un seul allèle clivé si hétérozygote muté
- aucun allèle clivé si homozygote muté
Avec l’analyse de fragments que pouvons-nous mettre en évidence ?
De courtes insertions/délétions pour la détection d’un polymorphisme (= nombre de répétitions d’un dinucléotide) et l’analyse des microsatellites dans les tumeurs
Quelles sont les étapes de réalisation de l’analyse de fragments ?
- amplification de la région à analyser (contenant le site polymorphe)
- utilisation d’amorces fluorescentes
- électrophorèse en gel capillaire
- détection des fragments marqués dans un séquenceur => pics
- possibilité d’analyser plusieurs sites polymorphes en même temps (PCR multiplex)
Expliquez la technique
En gros on détermine la taille d’un microsatellite grâce à des marqueurs de taille dont certains vont pouvoir encadrer la taille du microsatellite et la machine va réussir à déterminer sa taille, c’est une sort d’étalonnage
Comment est représenté le résultat d’une PCR en temps réel ?
Il est représenté graphiquement sous forme de courbes sigmoïdes
Que correspond chaque courbe ?
Chaque courbe correspond à un échantillon, représente la mesure de la fluorescence (Sybr green) de cet échantillon à chaque cycle de PCR
Qu’est-ce que le Sybr green ?
C’est un agent intercalent qui est activé fluorescent lorsqu’il se trouve dans l’ADN double brin
Comment varie la fluorescence ?
Elle est proportionnelle au nombre de fragments PCR générés
Qu’est-ce que le cycle seuil ?
C’est le moment où le signal s’écarte significativement de la valeur du bruit de fond
Comment est la variation du cycle seuil par rapport à la quantité d’ADN ou ADNc de départ ?
Elle est inversement proportionnelle à la quantité d’ADN ou ADNc de départ
Quelles sont les applications de la PCR en temps réel ?
PCR quantitative :
- détermination du nombre de copies d’un gène
- quantification des transcrits (relative ou absolue => gène de référence ou gamme étalon) (RT PCR en temps réel)
Quelle est la deuxième application de la PCR en temps réel ?
La discrimination allélique par sondes fluorescentes, une méthode de génotypage : on va déterminer la présence ou l’absence d’une mutation de manière ciblée (on sait précisément quelle mutation)
Expliquez cette deuxième approche
On va en gros utiliser deux sondes, une mutée et une non mutée, qui vont s’hybrider avec la séquence avec 100% de compatibilité et ensuite hydrolysé par la polymérase ce qui va activer la molécule fluorescente
Quels signaux pouvons-nous détecter ?
- chez un homozygote : un signal fluorescent seulement, celui muté ou celui non muté
- chez un hétérozygote : les deux signaux fluorescents
Quelles sont les caractéristiques de cette méthode ?
- rapide
- ciblée
- adaptée pour un nombre limité de mutations dans un gène donné
- très utilisée en diagnostic
- peu coûteuse
