Intro PCR och qPCR Flashcards
PCR-principen?
- Dela upp DNA-sträng
- Inbindning av primers
- DNA-syntes
- Exponentiell amplifiering
Komponenter i PCR-reaktionen
Extraktionsmetoder DNA/RNA?
Hur går extrationen till och vad får du ut?
• Dela upp DNA-sträng
• Inbindning av primers ?
- Byggstenar
- Att tänka på vid tillverkning
- Annealingtempraturen
- DNA-syntes
- Exponentiell amplifiering
Oligonukleotider som är ca 18-24 baser (max 30)
• Byggstenar
Deoxyribose nucleoside triphosphate (dNTP)
dATP, dTTP, dCTP, dGTP
Att tänka på vid tillverkning:
- GC innehållet (max 60%)
- Undvik långa sträckor av en enda nukleotid
- Tm-värdet (likvärdigt för FP och RP)
- Undvik att primrarna är komplementära med sig själva eller med varandra
Tumregel för annealingtemperaturen:
Starta med en temperatur som är 5 grader lägre än primrarnas smälttemperatur.
• Dela upp DNA-sträng
• Inbindning av primers
• DNA-syntes?
- buffert
- Reverst transcriptas
- DNA-polymeras
• Exponentiell amplifiering
DNA polymeras: Påskyndar sammanfogningen av dNTP
Buffert:
• MgCl2
- Koncentrationen kan varieras (2-4 mM)
- Co-faktor till DNA polymeras
RT (Reverse transcriptase) -PCR
RNA omvandlas til lcDNA med hjälp av enzymet reverse transcriptase
Specifikaprimers, oligo(dT)s, random primers
DNA-RNA hybrid
RNA bryts ned enzymatiskt
ssDNA komplementärt till det ursprungliga RNAt
• Dela upp DNA-sträng
• Inbindning av primers
• DNA-syntes?
• Exponentiell amplifiering
Kan göras med?
Vad är de?
Detektion av det amplifierade materialet
Amplifiering= kopiering av målsekvens
- Gelelektrofores, agaros
- Infärgning av DNA:
Etidium Bromid
Gel Red
Sybr green
Nestad PCR?
- Vad hamnar primers?
- Fördel och risk?
Realtids-PCR (qPCR)?
SYBR Green?
Probe?
En probe är en nukleotidsekvens märkt med en fluorofor som binder till målsekvensen mellan primrarna.
vad är överstruket?
*Förklara de 2 översta faserna
Exponentiell amplifiering: Vid varje cykel fördubblas mängden produkt
Platå: Ingen produkt ackumuleras längre på grund av förbrukning av reagens och enzym.
Multiplex qPCR / RT-qPCR?
- Vad används?
- förhållandet mellan primer/probe?
Vad står q för i qPCR?
Problem vid qPCR kan bero på?
- Primer design
- Primerkoncentration
- Annealingtemperatur
- MgCl2 koncentration
- Sekundärstrukturer
Fördelar qPCR?
- Högre specificitet (probe)
- Mindre risk för kontamination
- Möjlighet att kvantifiera
- ”Synlig” reaktion
- Tidseffektiv
när kan du tillämpa PCR ?
Digital droplet PCR (ddPCR)?
- Kvantifiering?
- vad genereras?
- Hur sker mätning
hur avläser du detta diagram?
- Ct värde
- Högst lägst ct värde?
Skillnad på kvalitativ och kvantitativ analys vid realtids pcr?
Kvantitativ: Antal virus
Kvalitativ: Finns de virus eller ej
vad innehåller mastermix
Enzymer
MgCl2
dNTP
Vanligtvis består en PCR av en serie av 40 upprepade temperaturförändringar, så kallade cykler, där varje cykel normalt omfattar 3 tydligt avgränsade temperatursteg.
Vilka är dem?
*egen fråga ej från pp
Denatureringssteg: upphettning av reaktionsblandningen -> DNA-strängarna i templatet separerar (vätebindningarna mellan komplementära baser bryts) -> enkelsträngade DNA-molekyler.
Hybridiseringssteg (annealing): Reaktionstemperaturen sänks ->primrarna hybridiserar de enkelsträngade DNA-templaten.
Förlängningssteg (Elongering): DNA-polymeraset syntetiserar en ny DNA-sträng som är komplementär till templatet genom att tillsätta nukleotider som är komplementära till templatet i riktning från 5’-änden till 3’-änden.
Detta leder till en exponentiell amplifiering av det specifika DNA-fragmentet.
vad är DNA- sekvensering?
DNA sekvensen utgör?
När är sekvensering viktigt?
*egen fråga ej från pp
DNA-sekvensering är den process som används för att med biokemiska metoder bestämma ordningen av nukleotiderna (adenin, guanin, cytosin och tymin) i DNA.
DNA-sekvensen utgör den ärvda genetiska informationen i celler.
Viktigt för att identifiera ärftliga sjukdomar och, i förlängningen, hur man skall bota dem.
vad menas med kvantifiering?
metod för noggrann bestämning av mängden av en mål-DNA-sekvens
