Contrôle de qualité et techniques de base Flashcards
Nommer des facteurs pré-analytique pour l’analyse en biologie moléculaire de tissus FFPE
Ischémie froide
Décalcification
Durée de fixation
Durée entreposage bloc paraffine
Taille du spécimen
Tampon de fixation
Ratio fixateur/tissu
Température de fixation
Taille du bloc FFPE
Encre
Âge du fixateur
Exposition lumière …
Quelles sont les 4 grandes étapes pour les facteurs pré-analytiques FFPE?
Pré-fixation
Fixation
Éclaircissement, imprégnation et enrobage
Manutention et stockage
Quels sont les facteurs influancant la pré-fixation?
Quelle est la méthode de décalcification la plus utile pour l’analyse de l’ADN ou ARN?
EDTA
EDTA vs méthodes acides:
- amplification de fragments plus longs
- signaux FISH plus intenses et moins de bruit de fond
Quels sont les facteurs influancant la fixation?
Quels sont les facteurs influancant l’enrobage?
Quels sont les facteurs influencant la manutention et le storage?
Qu’est qui influence en bonne partie notre analyse pour la qualité du tissu soumi pour la biologie moléculaire?
Quantité de cellules tumorales (indicateur de qualité)
Nécrose
Que doit-on faire s’il y a des inhibiteurs dans notre tissu?
Diluer l’ADN pour les éliminier
Quelles sont les limitations de l’isolation de l’ADN en bloc de paraffine
- Déparaffiner (xylène endommage les ac. nuc)
- Formol: - réduit la quantité et la qualité
- crosslink
- fragmentation
- forme des adduits mono-methylol (surtout avec adénine)
- dégradation enzymes = perte d’intégrité
- Ne pas utiliser d’autres types de fixateur
- Digestion du tissu: protéinase K
- Cytologie (et petites biopsies): présence d’agar
- extraction manuelle
- Hétérogénéité (macro-dissection?)
- Acides nucléiques fragmentés
- Limiter l’utilisation de décalcifiant
Comment conserver un échantillon si on veut isoler l’ARN?
ARN, au moment du prélèvement:
- azote liquide ou -80°C
- utilisation d’un stabilisateur: 1 jour à 37°C
7 jours à TP
semaines à -20°C
ARN: - à court terme: eau RNase free, EDTA, Tris-EDTA
- citrate de sodium 1 mM stable 1 an à -80°C
- formamide stable 1 an à -20°C
Comment conserver un échantillon si on veut isoler l’ADN?
ADN: - semaines à 4°C dans Tris-EDTA
- mois à -20°C dans Tris-EDTA
- années à -80°C, précipité dans l’étahanol
- décennies dans l’azote liquide
Comment peut-on doser l’ADN ou l’ARN dans un échantillon?
Spectrophotomètre
Fluoromètre
Bioanalyseur
Quel est le but du PCR imbriqué?
Ajouter de la spécificité
Quels sont les avantages du PCR digital?
-Pas besoin de courbe standard
-
-Précis
-
-Reproductible
-
-Sensible
Quelles sont les applications du PCR digital?
-Détection d’événements rares
-
-Variation du nombre de copies
-
-Expression génique
-
-Quantification de librairies pour NGS
Nommer des exemples de variations de PCR
Méthylation-specific PCR
Hot-start PCR
Touchdown PCR
Multiplex-PCR
Ligation-mediated PCR
Whole Genome Amplification
Grâce à quelle valeur on peut quantifier l’ADN dans un qPCR?
Valeur CT et courbe standard
Avec quelle méthode de PCR on détecte les mutations dans EFGR?
ARMS (Amplification refractory mutation system)
Comparer la sensibilité de HRM, TaqMan et Sorpion-ARMS
Nommer d’autres méthodes d’analyses autres que le PCR
CGH array
Cytométrie de flus
FISH
CISH
Séquençage
Que peut-on détecter avec un CGH array?
Amplification
Délétion
Trisomie
Qu’est-ce qui ne peut être détecté par un CGH array?
Translocations équilibrées
Inversions
Quels sont les critères pour définir l’analyse par PCR de l’instabilité des microsatellites?
MSI-H: instabilité pour au moins 2 des 5 marqueurs microsatellites
MSI-L: instabilité pour 1 des 5 marqueurs microsatellites
