Contrôle de qualité et techniques de base

Question 1

Nommer des facteurs pré-analytique pour l’analyse en biologie moléculaire de tissus FFPE

Answer 1

Ischémie froide

Décalcification

Durée de fixation

Durée entreposage bloc paraffine

Taille du spécimen

Tampon de fixation

Ratio fixateur/tissu

Température de fixation

Taille du bloc FFPE

Encre

Âge du fixateur

Exposition lumière …

Question 2

Quelles sont les 4 grandes étapes pour les facteurs pré-analytiques FFPE?

Answer 2

Pré-fixation

Fixation

Éclaircissement, imprégnation et enrobage

Manutention et stockage

Question 3

Quels sont les facteurs influancant la pré-fixation?

Answer 3

Question 4

Quelle est la méthode de décalcification la plus utile pour l’analyse de l’ADN ou ARN?

Answer 4

EDTA

EDTA vs méthodes acides:

• amplification de fragments plus longs
• signaux FISH plus intenses et moins de bruit de fond

Question 5

Quels sont les facteurs influancant la fixation?

Answer 5

Question 6

Quels sont les facteurs influancant l’enrobage?

Answer 6

Question 7

Quels sont les facteurs influencant la manutention et le storage?

Answer 7

Question 8

Qu’est qui influence en bonne partie notre analyse pour la qualité du tissu soumi pour la biologie moléculaire?

Answer 8

Quantité de cellules tumorales (indicateur de qualité)

Nécrose

Question 9

Que doit-on faire s’il y a des inhibiteurs dans notre tissu?

Answer 9

Diluer l’ADN pour les éliminier

Question 10

Quelles sont les limitations de l’isolation de l’ADN en bloc de paraffine

Answer 10

• Déparaffiner (xylène endommage les ac. nuc)
• Formol: - réduit la quantité et la qualité
• crosslink
• fragmentation
• forme des adduits mono-methylol (surtout avec adénine)
• dégradation enzymes = perte d’intégrité
• Ne pas utiliser d’autres types de fixateur
• Digestion du tissu: protéinase K
• Cytologie (et petites biopsies): présence d’agar
• extraction manuelle
• Hétérogénéité (macro-dissection?)
• Acides nucléiques fragmentés
• Limiter l’utilisation de décalcifiant

Question 11

Comment conserver un échantillon si on veut isoler l’ARN?

Answer 11

ARN, au moment du prélèvement:

• azote liquide ou -80°C
• utilisation d’un stabilisateur: 1 jour à 37°C

7 jours à TP

semaines à -20°C

ARN: - à court terme: eau RNase free, EDTA, Tris-EDTA

• citrate de sodium 1 mM stable 1 an à -80°C
• formamide stable 1 an à -20°C

Question 12

Comment conserver un échantillon si on veut isoler l’ADN?

Answer 12

ADN: - semaines à 4°C dans Tris-EDTA

• mois à -20°C dans Tris-EDTA
• années à -80°C, précipité dans l’étahanol
• décennies dans l’azote liquide

Question 13

Comment peut-on doser l’ADN ou l’ARN dans un échantillon?

Answer 13

Spectrophotomètre

Fluoromètre

Bioanalyseur

Question 14

Quel est le but du PCR imbriqué?

Answer 14

Ajouter de la spécificité

Question 15

Quels sont les avantages du PCR digital?

Answer 15

-Pas besoin de courbe standard

-

-Précis

-

-Reproductible

-

-Sensible

Question 16

Quelles sont les applications du PCR digital?

Answer 16

-Détection d’événements rares

-

-Variation du nombre de copies

-

-Expression génique

-

-Quantification de librairies pour NGS

Question 17

Nommer des exemples de variations de PCR

Answer 17

Méthylation-specific PCR

Hot-start PCR

Touchdown PCR

Multiplex-PCR

Ligation-mediated PCR

Whole Genome Amplification

Question 18

Grâce à quelle valeur on peut quantifier l’ADN dans un qPCR?

Answer 18

Valeur CT et courbe standard

Question 19

Avec quelle méthode de PCR on détecte les mutations dans EFGR?

Answer 19

ARMS (Amplification refractory mutation system)

Question 20

Comparer la sensibilité de HRM, TaqMan et Sorpion-ARMS

Answer 20

Question 21

Nommer d’autres méthodes d’analyses autres que le PCR

Answer 21

CGH array

Cytométrie de flus

FISH

CISH

Séquençage

Question 22

Que peut-on détecter avec un CGH array?

Answer 22

Amplification

Délétion

Trisomie

Question 23

Qu’est-ce qui ne peut être détecté par un CGH array?

Answer 23

Translocations équilibrées

Inversions

Question 24

Quels sont les critères pour définir l’analyse par PCR de l’instabilité des microsatellites?

Answer 24

MSI-H: instabilité pour au moins 2 des 5 marqueurs microsatellites

MSI-L: instabilité pour 1 des 5 marqueurs microsatellites