Clonalité

Question 1

Définir clonalité

Answer 1

Clonalité: groupe de cellules génétiquement identiques à une cellule « ancestrale » unique.

Question 2

Est-ce que clonlité = malignité?

Answer 2

Pas toujours, utilité diagnostique

Certaines population clonales de lymphocytes sont observées dans certains processus réactionnels

Question 3

Qu’est-ce qui fait la spécificité d’un lyB?

Answer 3

immunoglobuline produite

• Ig (anticorps)
• 2 chaînes lourdes identiques (IGH)
• 2 chaînes légères identiques

soit kappa (IGK), soit lambda (IGL)

Réarrangements uniques dans les gènes des Ig

Question 4

Qu’est-ce qui fait la spécificité d’un lyT?

Answer 4

TCR exprimé

Réarrangements uniques dans les gènes des TCR

Question 5

Par quel processus il y a le réarrangements des gènes qui codent pour les Ig et TCR?

Answer 5

recombinaison VDJ

Question 6

Qu’arrive-t-il lors de la recombinaison homologue de la chaîne légère?

Answer 6

Exclusion allélique

Expression lambda et kappa

(En hématologie, on peut voir en cytogénétique lambda mais dans nos analyses détecter kappa)

Question 7

Quelle est la diversité estimée des molécules Ig ou TCR?

Answer 7

10¹² chacune

Question 8

Dans quelle situation on analyse la clonalité?

Answer 8

Majorité des patients avec suspicion d’un désordre lymphoprolifératif:

-histologie, immunohistochimie, cytométrie de flux = DIAGNOSTIC

MAIS:

• Dans 5-15% des cas, le diagnostic est plus difficile
• évaluation de la clonalité des lymphocytes par PCR

= outil de DIAGNOSTIC

Question 9

Quelle est l’analyse utilisée à HSS pour la détection de la clonalité?

Answer 9

PCR multiplex - résumé

• Amorçes V et J
• Amplification par PCR du réarrangement V-D-J
• Migration et visualisation des produits de PCR sur gel
• Si population hétérogène de lymphocytes B (tous différents, polyclonaux) = produits de PCR de différentes longueurs
• Si population clonale d’un lymphocyte B (identiques; lymphome?) = abondance d’un seul produit de PCR d’une taille spécifique

Question 10

À quelle moment de la différentiation a lieu le réarrangement VDJ?

Answer 10

Pendant la différentiation

Indépendant de la stimulation Ag

Question 11

Quand a lieu les mutations hypersomatiques (MSH) des gènes Ig?

Answer 11

Mutations ponctuelles après les réarrangements (après la différentiation et la différencitation des lyB) pour augmenter la variabilité des Ab produits

Question 12

Comment les MHS peuvent-ils interférer avec une analyse de clonalité?

Answer 12

FN

Peuvent interférer avec l’hybridation des amorces

Question 13

Comment peut-il y avoir un FP pour les tests de clonalité?

Answer 13

• La sensibilité du PCR peut causer l’amplification de réarrangements, Ig ou TCR, d’apparence clonale, qui proviennent d’une petite quantité de lymphocytes B ou T dans le tissu analysé
• une petite biopsie à l’aiguille qui contient peu de lymphocytes B ou T -très faible quantité de lymphocytes
• PCR effectué avec < 20 ng ADN (50-200 ng recommandé, 1000 lymphocytes)
• Peut être causé par une réponse inflammatoire arrivée/activation de lymphocytes dans une lésion, qui sont spécifiques pour un Ag IMMUNOSPÉCIFICITÉ
• Gènes du TCR plus souvent sujets aux faux positifs (pseudoclonalité)

Question 14

Nommer une difficulté d’interprétation des résultats

Answer 14

Bi-clonalité ou réarrangement bi-allélique

• observation de 2 bandes ou 2 pics pour un même réarrangement
• réarrangement bi-allélique, le lymphocyte réarrange ses 2 allèles (fréquent)
• bi-clonalité: 2 populations clonales différentes (peu fréquent – dans 5% des lymphoproliférations à cellules B matures)

Cas discordants avec le Dx du pathologiste

Question 15

Quelle est la sensibilité de détection du PCR de clonalité?

Answer 15

1 à 10 % (si présence de 1 à 10 lymphocytes clonaux sur 100 = détection)

Question 16

Combien y a-t-il de réactions pour un PCR de clonalité?

Answer 16

réarrangements des Ig = 8 réactions de PCR

réarrangements des TCR = 6 réactions de PCR

translocations BCL2-IGH et BCL-IGH = 4 réactions de PCR

total de 18 réactions 107 amorçes différentes – multiplex –

Question 17

Quelle est la quantité d’ADN ajoutée à la réaction pour éviter la pseudoclonalité?

Answer 17

PCR effectué avec 50-200 ng d’ADN (minimum de 1000 lymphocytes) = éviter la pseudoclonalité

Question 18

Comment préviens-t-on les FN?

Answer 18

-mauvaise hybridation des amorçes (ex: mutations hypersomatiques - MHS)
= amorçes multiplex et inclusion de certains réarrangements non-affectés par les MHS

Question 19

Comment préviens-t-on les FP?

Answer 19

-mauvaise discrimination entre bandes polyclonales vs monoclonales
= technique hétéroduplex élimine les bandes non-spécifiques