Chap 8 Flashcards
Dans une chromatographie par anion, la molécule est chargée neg ou positive ?
Neg
Dans une chromatographie par cation, la molécule est chargée neg ou positive ?
Positive
Quels sont les 3 etapes d’une purification ? Les decrire
1 : capturer isoler et concentrer (Velution rapide et grosse colonne)
2 : purifier retirer grosses imputées (Velution moyen moins grosse colonne plus petite resine)
3 : Polir et retirer les petites impuretés
Entre une charge nette de -3 et 0 qui va mieux adsorper a la resine ?
-3 car une plus forte charge nette de la molécule donne une plus grande adsorption
Quelles sont les deux methodes de desorption ?
1-Diminution de la charge nette par changement de pH
2-Augmentation de la concentration d’ions compétitifs (sel)
3 types d’échangeur pour anion ? (pH plus ou moins 6-9)
DEAE (diethylaminoethyl) faible
QAE (aminoethyl) fort
Q (ammonium) fort
3 types d’echangeur de cations (pH plus ou moins 6-9)
Carboxymethyl faible
Sulfopropryl fort
Methyl sulfonate fort
Qu’est ce qu’on met pendant l’etape d’equilibration ?
Tampon d’equilibration (peu de sel)
Lorsque qu’on applique l’echantillon dans la colonne (chromato anion) : il se passe quoi ? Tampon ?
Tampon de lyse
Mol - se lient a resine +
Neutre et + sortent direct avec le volume mort
Comment de passe la phase d’elution par gradient ?
On ajoute progressivement de plus en plus de sel en consequence :
Les charges faibles sortent en 1er puis celles qui sont le plus aggrippees a la resine (fortes) en dernier
A la fin de la chromato faut faire quoi si on veut la réutiliser ?
Tampon de regeneration avec Tampon B 100% puis Tampon A 100%
Quels sont les 5 avantages de la chromatographie par ions ?
Méthode tres flexible (sel et pH)
Choix cation ou anion
Bcp de résines (résolution/uniformité)
Resine pas cher
Purification possible avec des detergents sans charge et en presence d’urée
Les 3 limites de la chromato d’ions ?
Methode pas tres specifique
Pas possible d’utiliser la guanidine car chargee (en denaturant)
Necessite d’un système a deux pompes
Du coup la chromatographie par ions est plus utile pour lesquelles des 3 étapes citees en amont ?
1 et 2
Concentrer isoler et purifier les grosses mol
Mais PAS les petites
Principe de la chromatographie par filtration sur gel ?
Separation basee sur la taille moleculaire
La chromatographie par filtration est plus efficace dans laquelle des 3 etapes ?
Dans la purification de grosses et surtout de petites molécules
Est ce que plus les proteines penentrent dans les pores plus le temps de migration est grand ?
Ouiii
Est ce que la chromatographie par filtration peut se faire avec des protéines dénaturées ?
Oui avec des agents chaotropiques comme l’urée qui permettent de maintenir les protéines en solution
Condition à respecter lors de l’application de l’échantillon dans une chromatographie par filtration ?
On veut minimiser le volume d’application pour une meilleure résolution donc on veut moins de protéines
Est ce qu’il y’a un avantage dans l’elution par gradient dans la chromatographie par filtration ?
Non on n’est pas obligé de changer le tampon (contrairement aux autres chromato)
Quel est l’ordre d’elution des protéines dans une chromatographie par filtration ?
Les grosses sortent en 1er car aucun acces au pores et ainsi de suite
Avantages de la chromatographie par filtration ? (5)
Bcp de résines
Pas cher
Purification est possible avec des détergents et denaturants chargees ou non
Bonne methode de purif pour les proteines dans les corps d’inclusion
Pas besoin de gradient pour elution
3 limites dans la chromatographie par filtration
Pas bien pour purifier des grandes quantités de protéines
Resine pas résistante et pas durable
Vitesse d’écoulement tres faible
Principe de la chromato phase inverse ?
Separation par interaction hydrophobe
La desorption de proteines avec solvant organique
Pour laquelle des 3 etapes la chromato inverse est le mieux ?
3 etape seulement
Purification (polir) de PETITES impuretés
Etape d’equilibration en phase inverse ?
Tampon équilibration avec tres faible concentration en solvant organique
Etape d’elution en phase inverse? Ordre elution ?
Elution par gradient augmentation de concentration de solvant organique
En 1er sorte les plus polaire et en dernier les plus hydrophobes
Pour la régénération en phase inverse ?
100% de tampon B
Dans le choix de colonnes en phase inverse qui lie mieux les petites protéines ?
C18 avec longue chaune aliphatique
(Grosse prot = C1)
Avantage de la chromatographie en phase inverse (4)
Plusieurs résines
Bonne purification corps inclusion
Résine resistante et durables
Vitesse écoulement variée
Limites chromato phase inverse (4)
Colonne cher
Pas ouf pour grosse prot trop hydrophobe
Peut entrainer la denaturation
Equipment HPLC cherrr
Loi de beer lambert ?
A = ElC
Comment faire pour determiner la pureté d’une proteine ? Autre methode que chromato
Electrophorese SDS-Page
Principe de SDS PAGE
denaturant SDS
Separer selon la taille
Precis
Comment vérifier l’identité d’une protéine ? Autre que chromato ou sds page
Spectrométrie de masse (tooopp mais cher)
2 methodes de synthèse de l’ARN
Chimique (petits ARN)
Enzymatique in vitro avec ARN poly du bacteriophage T7
De quoi on a besoin pour synthese Enzymatique in vitro avec ARN poly du bacteriophage T7
Matrice ADNc
NTPs
Mg2+
pH 8
37 degres
Protocole de purification de l’ARN poly T7
Vecteur expression fusion his-tag
Purification resine de nickel
Purif avec echangeur d’anions ph 8
Purif filtration gel
Verif pureté
Les avantages du gel electrophorese denaturant pour purif ARN
Tres bonne résolution
Pas d’instrument de chromato
Purif de grosse quantité ARN
Les limites du gel electrophorese denaturant pour purif ARN
Long et fastidieux
Denaturation systématique
Contamination acrylamide
Quelques faits sur la purif de l’ARN par chromato affinité ?
Rapide
Besoin ARN fusion contenant ARN d’interet et un tag
Resine forte affinité au tag
Methode Aribo-Tag cherche a faire quoi ?
Maximise le rendement et la pureté d’ARN
avec ARN poly bacteriophage T7 avec ARN fusionne a Aribo-tag
Le ribozyme glmS coupe seulement quand quoi ?
Presence de GlcN6P
Les 3 etapes de la purification par affinite avec le ARiBo-Tag
1- Transcription in vitro de l’ARN fusionné à ARiBo
2 - Immobilisation de l’ARN
Avec lisaion forte entre BoxB et Lambda N
3 - Autoclivage avec la GlcN6P et elution de l’ARN
