Chap 12 : Interactions Macromoleculaires - Affinité Et Spécificité

Question 1

Pour quelle valeur de KD les interactions proteines proteines in vivo sont généralement inefficaces ?

Answer 1

KD < 10^-6 M

Question 2

Quels sont les 5 facteurs in vivo determinant pour la formation de complexes

Answer 2

Conditions physicochimiques
Bon repliement
Compartimentalisation cellulaire
Modification covalente
Cofacteur

Question 3

Quels sont les 3 interactions dont nous allons discuter ici ?

Answer 3

Proteine-proteine

Adn-proteine

Arn-proteine

Question 4

Les 4 méthodes qu’on va utiliser pour identifier les interactions prot-prot ?

Answer 4

Co-immunoprecipitation
Essai de marquage par proximité
Methode double-hybride
Methode complementation de prot

Question 5

La methode qu’on va utiliser pour identifier les interactions adn-prot ?

Answer 5

ChIP

Question 6

La méthode qu’on va utiliser pour identifier les interactions ARN-prot ?

Answer 6

CLIP

Question 7

Comment fonctionne co-immunoprecipitation ?

Answer 7

Selection d’un prot connu par son AC et on fait un wb pour détecter prot specifique. On ne peut pas savoir si l’interaction est direct ou indirect

Question 8

Conditions pour mon montrer une interaction par co-IP avec WB

Answer 8

Hypothèse de identite A et B
Ac qui correspondent (pas interference)
Interaction stable en presence de détergent

Question 9

L’avatange de la co-IP

Answer 9

Demontre des interactions entre proteines endogene dans la cellule

Question 10

4 desavantages de la Co-IP

Answer 10

Faux positifs
Pas savoir si interaction direct
Ac cher
Sensible a la lyse

Question 11

L’inconvenient majeur de la methode co-IP ?

Answer 11

Difficulté de générer un AC spécifique pour la proteine cible

Question 12

Dans le cas d’une co-IP avec taf : 2 avantages et 2 inconvénients ?

Answer 12

Avantages :
Mm etiquette reutilisable
2 étiquette = doubles purif

Inconvenients :
Masquer le site de liaison
Expression a partir de vecteurs d’expression

Question 13

2 avantages et 4 limites de la détection de prot co-IP par MS

Answer 13

Avantages :
Criblage a haut debit des prot
Possibilite d’identification du gene

Inconveniences:
Faux positifs
Fragments hydrophobes pas analysables
Besoin de repeter l’experience
Bcp de donnees complexes

Question 14

C’est quoi la methode Chip ? IP de la krmatine

Answer 14

Variante de la CO-IP mais pour Adn-prot
Identifier par ChIPseq

Question 15

Comment identifier les liaisons prot-ARN ? 2

Answer 15

Par RIP natif (pas de crosslink) : RNA-IP bcp de faux positifs

Par PAR-CLIP : crosslink qui permet l’identification du site de liaison
Moins de faux positifs

Question 16

C’est quoi un essai de marqua par proximité ?

Answer 16

Littéralement comme un ELISA avec streptavidine et biotine

Question 17

2 avantages du marquages par proximité et 3 inconvénients ?

Answer 17

Avantages
Détections des prot avant la lyse
Detection indirecte de la localisation cellulaire de notre prot

Inconvients
Mesure simplement proximite prot et prot biotine mais pas interaction
Fusion ligase-prot = faux positifs/faux negatifs
Creation artefact du a l’expression exogene de prot de fusion

Question 18

C’est quoi le concept du double hybride ?

Answer 18

On construit deux prot hybrides

On fusionne la prot appat avec le domaine de liaison a l’ADN d’un activateur transcriptionnel

Et on fusionne le domaine activateur d’un activateur transcriptionnel avec un domaine qui lie la proteine proie

Question 19

4 avantages du concept double hybride et 2 inconvénients ?

Answer 19

Avantages
Interaction directes
Pas hypothese on test au pif
Peut rester la réciprocité
Criblage a haut debit

Inconvenient
Les interactions dependent de la sur expression de prot de fusion dans le noyau donc possible FAUX positifs
On ne peut pas conclure une absence d’interaction

Question 20

Comment fonctionne la methode de complementation de fragments proteiques ?

Answer 20

En gros tu prends la proteine d’interet que tu sépares en 2 fragments tu en choisis que tu vas exprimer dans des cellules (et tagger) si il y’a formation d’un complexe avec un autre bout de proteine c’est que y’a interaction !!

Question 21

4 avantages pour la methode complementation de fragments proteiques et 2 inconvénients

Answer 21

Avantages
Parfait pour etude in vivo en réel conditions
Tres sensibles
Tout type cellulaire
Plusieurs applications

Inconvenient
Parfois auto assembly des fragments
Parfois faux positifs et négatifs

Question 22

C’est quoi interactome ? Aide a quoi ?

Answer 22

Ensemble des interactions moléculaires de la cellule grave au interaction prot-prot
Deduire la fonction de la prot inconnue

Question 23

Quelles sont les 3 methodes pour vérifier les interactions directes des prots ?

Answer 23

Résonance plasmodique de surface
Calorimetrie à titrage isotherme
Retard sur gel

Question 24

Def affinite et specificite

Answer 24

Affinite : force interaction non covalente Ka grand et Kd petit

Specificite : capacite d’une mol a lier un ligand spécifique a un autre

Question 25

C’est quoi la résonance plasmonique ?

Answer 25

Méthode biophysique qui permet de detecter en temps reel des interactions sur une molecule attachée a une surface (biocapteur)

Question 26

Principe de la SPR ?

Answer 26

L’analyte circule dans dans un tampon en flux constant en se liant et se détachant de son ligand qui est fixé sur le biocapteur ce qui decale la position de l’angle de resonnance

Question 27

Le produit de la SPR ? On peut extraire quelles infos ?

Answer 27

Sensorgramme en RU
Vitesse association et dissociation ainsi que les constantes

Question 28

5 avantages de la SPR et 2 inconvénients

Answer 28

Avantages :
Etude en temps reel
Applicable a bcp de mol complexes
Rapide
Donnees cinetiques
Pas de marqueurs fluorescent

Inconvenient
N’evalue pas l’homogeneite de l’echantillon
Immobilisation peut interfer avec son activité

Question 29

C’est quoi la calorimetrie a titrage isotherme ?

Answer 29

Permet de mesuere la chaleur generee ou absorbee par une interaction moléculaire en solution

Question 30

C’est quoi le flex de la methode de calorimetrie a titrage isotherme ?

Answer 30

METHODE PAR EXCELLENCE

Question 31

4 avantages de la calorimetrie a titrage isotherme et 3 inconvénients ?

Answer 31

Avantages:
Determine tous les paramètres de liaison d’un coup
Mesure le Kd direct et indirectement
Methode directe en solide
Pas de marquage ni immobilisation

Inconvénients
Impossible si deltaH nul
Besoin de bcp de matériel
Pas d’homogénéité mesurable

Question 32

Methode d’excellence pour etudier des interactions prot-Arn / Adn ?

Answer 32

Retard sur gel natif

Question 33

Le flex du du retard sur gel ?

Answer 33

Lui il peut vérifier L’HOMOGÉNÉITÉ conformationnelle des prot

Question 34

6 avantages du retard sur gel et 4 inconvénients

Answer 34

Avantages

Homogénéité verifiee
Facile/pas cher
Pas besoin de gross quantité
Mesure direct Kd
Peut reveler plusieurs complexes
Utilie pour definir site liaison ADN

Inconvenient

Pas a l’équilibre
Besoin de marquage ARN
Difficile si petit peptide
Difficile si complexe instable