Chap 12 : Interactions Macromoleculaires - Affinité Et Spécificité Flashcards
Pour quelle valeur de KD les interactions proteines proteines in vivo sont généralement inefficaces ?
KD < 10^-6 M
Quels sont les 5 facteurs in vivo determinant pour la formation de complexes
Conditions physicochimiques
Bon repliement
Compartimentalisation cellulaire
Modification covalente
Cofacteur
Quels sont les 3 interactions dont nous allons discuter ici ?
Proteine-proteine
Adn-proteine
Arn-proteine
Les 4 méthodes qu’on va utiliser pour identifier les interactions prot-prot ?
Co-immunoprecipitation
Essai de marquage par proximité
Methode double-hybride
Methode complementation de prot
La methode qu’on va utiliser pour identifier les interactions adn-prot ?
ChIP
La méthode qu’on va utiliser pour identifier les interactions ARN-prot ?
CLIP
Comment fonctionne co-immunoprecipitation ?
Selection d’un prot connu par son AC et on fait un wb pour détecter prot specifique. On ne peut pas savoir si l’interaction est direct ou indirect
Conditions pour mon montrer une interaction par co-IP avec WB
Hypothèse de identite A et B
Ac qui correspondent (pas interference)
Interaction stable en presence de détergent
L’avatange de la co-IP
Demontre des interactions entre proteines endogene dans la cellule
4 desavantages de la Co-IP
Faux positifs
Pas savoir si interaction direct
Ac cher
Sensible a la lyse
L’inconvenient majeur de la methode co-IP ?
Difficulté de générer un AC spécifique pour la proteine cible
Dans le cas d’une co-IP avec taf : 2 avantages et 2 inconvénients ?
Avantages :
Mm etiquette reutilisable
2 étiquette = doubles purif
Inconvenients :
Masquer le site de liaison
Expression a partir de vecteurs d’expression
2 avantages et 4 limites de la détection de prot co-IP par MS
Avantages :
Criblage a haut debit des prot
Possibilite d’identification du gene
Inconveniences:
Faux positifs
Fragments hydrophobes pas analysables
Besoin de repeter l’experience
Bcp de donnees complexes
C’est quoi la methode Chip ? IP de la krmatine
Variante de la CO-IP mais pour Adn-prot
Identifier par ChIPseq
Comment identifier les liaisons prot-ARN ? 2
Par RIP natif (pas de crosslink) : RNA-IP bcp de faux positifs
Par PAR-CLIP : crosslink qui permet l’identification du site de liaison
Moins de faux positifs
C’est quoi un essai de marqua par proximité ?
Littéralement comme un ELISA avec streptavidine et biotine
2 avantages du marquages par proximité et 3 inconvénients ?
Avantages
Détections des prot avant la lyse
Detection indirecte de la localisation cellulaire de notre prot
Inconvients
Mesure simplement proximite prot et prot biotine mais pas interaction
Fusion ligase-prot = faux positifs/faux negatifs
Creation artefact du a l’expression exogene de prot de fusion
C’est quoi le concept du double hybride ?
On construit deux prot hybrides
On fusionne la prot appat avec le domaine de liaison a l’ADN d’un activateur transcriptionnel
Et on fusionne le domaine activateur d’un activateur transcriptionnel avec un domaine qui lie la proteine proie
4 avantages du concept double hybride et 2 inconvénients ?
Avantages
Interaction directes
Pas hypothese on test au pif
Peut rester la réciprocité
Criblage a haut debit
Inconvenient
Les interactions dependent de la sur expression de prot de fusion dans le noyau donc possible FAUX positifs
On ne peut pas conclure une absence d’interaction
Comment fonctionne la methode de complementation de fragments proteiques ?
En gros tu prends la proteine d’interet que tu sépares en 2 fragments tu en choisis que tu vas exprimer dans des cellules (et tagger) si il y’a formation d’un complexe avec un autre bout de proteine c’est que y’a interaction !!
4 avantages pour la methode complementation de fragments proteiques et 2 inconvénients
Avantages
Parfait pour etude in vivo en réel conditions
Tres sensibles
Tout type cellulaire
Plusieurs applications
Inconvenient
Parfois auto assembly des fragments
Parfois faux positifs et négatifs
C’est quoi interactome ? Aide a quoi ?
Ensemble des interactions moléculaires de la cellule grave au interaction prot-prot
Deduire la fonction de la prot inconnue
Quelles sont les 3 methodes pour vérifier les interactions directes des prots ?
Résonance plasmodique de surface
Calorimetrie à titrage isotherme
Retard sur gel
Def affinite et specificite
Affinite : force interaction non covalente Ka grand et Kd petit
Specificite : capacite d’une mol a lier un ligand spécifique a un autre
C’est quoi la résonance plasmonique ?
Méthode biophysique qui permet de detecter en temps reel des interactions sur une molecule attachée a une surface (biocapteur)
Principe de la SPR ?
L’analyte circule dans dans un tampon en flux constant en se liant et se détachant de son ligand qui est fixé sur le biocapteur ce qui decale la position de l’angle de resonnance
Le produit de la SPR ? On peut extraire quelles infos ?
Sensorgramme en RU
Vitesse association et dissociation ainsi que les constantes
5 avantages de la SPR et 2 inconvénients
Avantages :
Etude en temps reel
Applicable a bcp de mol complexes
Rapide
Donnees cinetiques
Pas de marqueurs fluorescent
Inconvenient
N’evalue pas l’homogeneite de l’echantillon
Immobilisation peut interfer avec son activité
C’est quoi la calorimetrie a titrage isotherme ?
Permet de mesuere la chaleur generee ou absorbee par une interaction moléculaire en solution
C’est quoi le flex de la methode de calorimetrie a titrage isotherme ?
METHODE PAR EXCELLENCE
4 avantages de la calorimetrie a titrage isotherme et 3 inconvénients ?
Avantages:
Determine tous les paramètres de liaison d’un coup
Mesure le Kd direct et indirectement
Methode directe en solide
Pas de marquage ni immobilisation
Inconvénients
Impossible si deltaH nul
Besoin de bcp de matériel
Pas d’homogénéité mesurable
Methode d’excellence pour etudier des interactions prot-Arn / Adn ?
Retard sur gel natif
Le flex du du retard sur gel ?
Lui il peut vérifier L’HOMOGÉNÉITÉ conformationnelle des prot
6 avantages du retard sur gel et 4 inconvénients
Avantages
Homogénéité verifiee
Facile/pas cher
Pas besoin de gross quantité
Mesure direct Kd
Peut reveler plusieurs complexes
Utilie pour definir site liaison ADN
Inconvenient
Pas a l’équilibre
Besoin de marquage ARN
Difficile si petit peptide
Difficile si complexe instable
