Chap 11 : Cryo-microscopie Electronique Flashcards
2 caractéristiques dont ont besoin les ME
Volatage
Vide
Les e- sont diffusés ou absorbés ?
Diffusés et le contraste augmente avec le defocus
C’est quoi transformation de fourier ?
Signal qui est transformé en fréquences constituantes
C’est quoi le CTF ?
Fonction de contraste de phase qui est une aberration degradant l’image du microscope
C’est quoi le dé focus ?
Compromis entre le contraste et la résolution typiquement entre 1um et 3um
Pour une meilleure resolution faut plus ou moins de de contraste ?
Peu de contraste
C’est quoi le meilleur détecteur d’electrons ?
Detecteur direct d’electrons
5 points importants du ME ?
Les images sont formées par la diffusion des électrons par le spécimen.
Le contraste est causé par l’interférence entre le rayon incident et diffusé
Le focus amplifie le contraste au détriment de la résolution maximale.
Les détecteurs d’électrons directes permettent de maximiser la détection d’électrons à haute IPS
Les échantillons typiques sont montés sur une grille de ME
3 Types de techniques ME
Analyse de particules unique
Tomographie
Cristallographique à électron
l’APU s’applique a quel type de mol ? Quelles sont les meilleures ?
N’importe quel mol purifiée
Celles de grandes tailles qui provoquent des grands contrastes
C’est quoi les limites de l’APU ?
Limite de taille faut que les prot soient assez grosses
>50 kDa
C’est quoi les diff entre coloration negative et cryo-ME
Coloration negative : marque la region sans prot possible d’analyse peu d’image car bcp de contraste mais limite de resolution
Cryo-ME : image bruyante donc besoin de bcp image mais bon resolution
Dans quel contexte on préfère utiliser la ME par colo négative ?
Criblage initial
Marche bien pour des proteines
Pk on utiliserait plutot la cryo-ME ?
Meilleure résolution mais demande bcp plus de données
La glace doit être vitrifiée tres vite aussi
Est ce que les e- causent des dommages aux mol ?
Oui il faut eviter ceux inutiles
Peut on corriger nos images ?
Oui si l’image est de bonne résolution on pourra bien estimer la CTF et la corriger
Comment on fait pour retrouver notre mol d’interet ?
Classification en 2D puis reconstruction en 3D dans l’espace de Fourier
C’est quoi la methode standard de reconstruction de nos jours ?
Reconstruction ab initio (a partir de données uniquement)
En prenant un blob gaussien et en filtrant les hautes fréquences pour eviter le bruit
Comment on fait pour estimer la résolution d’une reconstruction ?
Via la correlation de sphere de Fourier qui mesure une sphere pour faire deux reconstructions indépendantes
Il faut donc 2 reconstructions 3D separees
Comment déterminer l’hétérogénéité des complexes ?
Approche statistique
Les 6 etapes pour obtenir une structure de haute resolution en APU ?
1- ajuster la dose e- pour limiter les dommages
2- corriger les mouv particules
3- estimer et corriger CTF
4- sélectionner puis classifier les particules
5- reconstruire un modele 3D
6- Gerer les heterogeneites avec classification 3D
C’est quoi la tomographie ?
Plusieurs images du mm objet qui sont combinées pour une reconstruction 3D
Comment sont les échantillons et le voltage en tomographie ?
Plus epais
Plus haut
(Limite du cone manquant affecte la résolution)
Avantage de la cristallographie a electron que par rayon X ?
Les électrons interagissent mieux avec prot donc mm des petits cristaux peuvent générer de bons signals
Pb de la cristallo a e- ?
Dommage induit par le rayonnement
Donc dans la categorie imagerie de la Cryo-ME on a quel methode pour visualiser quoi ?
Cryo-tomographie : cellules , virus
Analyse de particules uniques : mol purifiees
Donc dans la categorie cristallographie de la Cryo-ME on a quel methode pour visualiser quoi ?
Cristallo 2D : cristaux 2D
Micro ED : microcristaux 3D
Qui a la meilleure limite de résolution et qui le plus rapide entre RMN cristallo X et cryo-ME ?
Cristallo x : limite de résolution a 0,5 A
Contre 2A pour RMN et 1.22A pour ME
Cristallo X est aussi la plus rapide (heures)
Un ptit resume final de la cryo-ME ?
Technique polyvalente, qui permet de visualiser des molécules purifiée et des cristaux et des échantillons cellulaires
Permet de visualiser de gros complexes macromoléculaire en solution avec peu de matériel.
