Chap 7 Flashcards
Les 4 applications des protéines et leur degres de purification
Étude activité : 80-90%
Étude de structure : plus de 95%
Application industrielle : 50%
Application thérapeutique : plus de 99%
Quelles sont les avantages de l’isolation des protéines des tissus animales ? (3)
Protéine native
modification post traductionnelle
pas cher
Quelles sont les limites de l’isolation des protéines des tissus animales ? (4)
Sources limitées
Petites quantités de prot specifique
Pas d’etiquette
Pas tjrs reproductible
Quels sont les avantages de l’expression de protéines dans la bactérie ? (4)
Beaucoup de protéines et milieu pas, cher
rapide, culture, expression,
beaucoup de vecteur d’expression différentes
expression de protéines marquées est facile (RMN et rayon X)
Quels sont les limites de l’expression de protéines dans la bactérie ? 3
Pas de modifs post traductionnelles ou ponts disulfures
Pas bon pour les prot membranaires
Differents codons chez la bactérie
Solutions au problème de codons rares chez les bactéries ?
La synthèse des genes avec optimisation de codons pour les bactéries
On utilise quoi dans l’expression dans la bactérie ?
Operon lac avec IPTG
Quels sont les avantages de l’expression de protéines dans la levure ? (3)
Bcp de protéines et milieux pas chers
Ponts disulfures et certaines modif post traductionnelles
L’expression de protéines marquées est possible
Quels sont les limites de l’expression de protéines dans la levure ? (3)
Moins rapide que bactéries
Différents codons chez la levure
Pas bonne pour les protéines glycosylées
On utilise quoi dans l’expression dans la levure ?
Induction avec MeOH
Quels sont les avantages de l’expression de protéines chez l’insecte ? (4)
Ponts S et modif post trad
Bon pour protéines glycosylees
Vecteurs avec His-Tag et GST-tag
Meilleurs codons pour les grosses protéines humaines
Quels sont les limites de l’expression de protéines chez l’insecte ? (3)
Pas rapide et peu de prot
Milieux speciaux
Prot marquee compliquee
Quel est le vecteur et les cell utilisees pour l’expression de prot chez les humains ?
Vecteur pTT
Cellules HEK293-E6
(Croissance en suspension avec chaperon (pas de pb de codon))
Quels sont les avantages de l’expression de protéines chez l’humain ? (4)
Ponts s modif tradu et prot membranaires
Pas immunogene
His tag
Codon parfait pour tres gross prot humaines
Quels sont les limites de l’expression de protéines chez l’humain ? (4)
Pas rapide peu de prot
Besoin d’un fermenteur
Milieux speciaux
Impossible de faire des prot marquee
Apprendre le resume d’expression
Photo galaerie
Lors d’une purif qu’est ce qui se retrouve dans le surnageant ? Peut on faire une purification illimitee ?
Proteines solubles
Oui nptk quelle technique est possible
Lors d’une purif qu’est ce qui se retrouve dans le culot ? Peut on faire une purification illimitee ?
Corps d’inclusion
Non agent denaturant et certains types de purification
La précipitation de protéines est utile pour quelle etape ?
1ere etape capturer et isoler c’est semi selectif
C’est quoi le concept de la précipitation saline de prot ?
Augmenter de 10% a chaque fois la précipitation de sels (sulfate ammonium)
C’est laquelle des chromato qui est le plus faisable avec des prot denaturees ?
Chromatographie phase inverse
Difference entre une elution isocratique (lineaire) ou par gradient ?
Lineaire c’est plus facile moins cher mais moins efficace
Comment se fait la detection des signaux en general dans une chromatographie ?
UV
Lambda absorption des groupes amides des chaines R ? Lambda absorption des AA aromatiques ?
En bas de 250 nm
En haut de 250 nm
Les 3 filtres uv les plus importants pour les proteines ?
214 nm ou 228 nm le + sensible detecte le lien amide
254 nm le - sensible que les noyeux aromatiques
280 nm uniquement tyr et trp (pas phe)
Principe de la chromato d’affinité ? Utiliser pour quelles etapes ?
Liaison specifique entre une prot et une resine qui est reversible
(On exploite une propriété biochimique unique de la prot)
Etapes 1 et 2
Exemples de prot ligands et prot fusion pour chromatographie affinite ?
Ligand
ATP
GTP
NADP
Fusion
GST
His-6
Role du bras espaceur ?
Minimise la liaison avec la matrice et les protéines
De quoi est composé le tampon d’elution dans chromato affinité ?
Tampon de liaison + competiteur
Quels sont les avantages dans la chromatographie d’affinité de fusion GST ? (3)
Augmente la solubilité de la protéine
Purif facile avec resine glutathion
Elution facile avec un petit ligand
Quels sont les desavantages dans la chromatographie d’affinité de fusion GST ? (3)
Gros tag
Purif pas possible avec denaturant (conformation native)
GST forme un dimere (pas optimal pour les essais biologiques)
Que faut il vérifier apres une chromatographie d’affinite ?
Verifier qu’il n’y a pas un site de coupure pour la protease de notre choix dans la prot
Les 3 proteases les plus populaires ?
Thrombine
Facteur Xa
TEV
Quels sont les avantages dans la chromatographie d’affinité de poly-his ? (4)
Purif facile avec resine nickel
Elution facile avec petit ligand
Purif possible avec détergents ET denaturants
Petite etiquette
Quels sont les limites dans la chromatographie d’affinité de fusion poly-his ? (3)
Augmente la formation de corps d’inclusion
Purif pas possible avec antioxy DTT
Pas bon pour les prot qui lient les metaux de transition
4 propriétés essentielles pour le competiteur ?
Liaison specifique mais reversible
Stable chimiquement et inerte
Pas trop cher
Petite taille moléculaire (separation dialyse)
