BI06 5-11 Flashcards
1
Q
geenitekniikka
A
biologisen tutkimustiedon pohjalta kehitetyt menetelmät, joilla eliöiden DNA:ta tai RNA:ta eristetään, analysoidaan, muokataan ja siirretään soluihin. Geenitekniikan kehittäminen on poikkitieteellistä, sillä menetelmät perustuvat solubiologian, molekyylibiologian, molekyyligenetiikan ja biokemian lisäksi muun muassa insinööritieteisiin.
2
Q
genomi
A
eliön koko perimä
3
Q
geeni
A
DNA-molekyylin toiminnallinen jakso, jotka sisältävät informaation geenituotteiden valmistamiseen. Geeni sisältää myös geenin ilmentymiseen tarvittavat säätelyalueet.
4
Q
geenituotteet
A
joko proteiineja tai RNA-molekyylejä, joilla on toiminnallisia vaikutuksia solussa
5
Q
miten yhdestä geenistä voidaan tuottaa useita geenituotteita?
A
Yhdestä geenistä voidaan vaihtoehtoisen silmukoinnin tai translaation jälkeen tapahtuvan muokkauksen avulla tuottaa erilaisia versioita samasta geenituotteesta
6
Q
DNA
A
ainutlaatuinen molekyyli, johon perinnöllinen informaatio on tallentuneena neljän erilaisen emäksen avulla. Geeneissä kolmen emäksen jakso vastaa yhtä proteiinin rakenneosaa, aminohappoa. Geenien sisältämän informaation perusteella rakentuu lähetti-RNA, joka välittää ohjeen proteiinin valmistamiseen. Osa geeneistä ohjaa erilaisten RNA-molekyylien, kuten mikro-RNA:n ja ribosomi- RNA:n, rakentumista. koostuu kahdesta juosteesta, joiden suunnat ovat vastakkaiset
7
Q
mitä genomiin kuuluu?
A
- proteiineja koodaavat geenit
- vain RNA:ta koodaavat geenit (esim. ribosomi-RNA ja siirtäjä-RNA)
- geenien ulkopuolinen alue
8
Q
DNA:n kahdentuminen
A
kahdentuu ennen solujen jakautumista. DNA-kaksoisjuoste avautuu, ja kummankin juosteen viereen alkaa kiinnittyä tumassa vapaana olevia DNA-nukleotideja emäsparisäännön mukaan oikeille paikoilleen. Vastinemäkset adeniini ja tymiini sekä sytosiini ja guaniini sitoutuvat toisiinsa. Solussa DNA:n kahdentumiseen osallistuu monia entsyymeitä, jotka aukaisevat kaksoisjuosteen, lukevat DNA:ta, liittävät oikeita nukleotideja syntyvään uuteen juosteeseen sekä liittävät DNA:n kappaleita yhteen.
9
Q
DNA-polymeraasi
A
DNA-polymeraasi pystyy liittämään uuden DNA-nukleotidin vain edellisen nukleotidin sokeriosan 3´OH-päähän. Siksi uudet DNA-juosteet rakentuvat eri suuntiin. DNA-polymeraasi tarvitsee aina olemassa olevan vapaan 3´ OH-pään, jonka perään se voi liittää lisää nukleotideja. rakentaa DNA-juostetta
10
Q
RNA-polymeraasit
A
Toisin kuin DNA-polymeraasi, RNA-polymeraasit eli RNA-molekyylejä rakentavat entsyymit voivat syntetisoida RNA:ta suoraan vastinjuosteelle. Erikoistunut RNA-polymeraasi, primaasi, valmistaakin ennen DNA:n kahdentumisen alkua lyhyen RNA-alukkeen, jonka OH-päähän DNA-polymeraasi voi alkaa lisätä nukleotideja. RNA-alukkeiden synteesi. rakentavat DNA-mallista RNA-molekyylin
11
Q
helikaasi
A
DNA-molekyylin emäsparien välisten vetysidosten katkaisu
12
Q
ligaasit eli liittäjäentsyymit (DNA-ligaasi)
A
DNA-palojen liittäminen
13
Q
korjaajaentsyymit
A
kahdentumisvirheiden korjaaminen
14
Q
DNA:n eristäminen
A
DNA:n eristäminen eri näytteistä tehdään useimmiten erilaisten kaupallisten reagenssien avulla. Tumallisten eliöiden geenit sijaitsevat pääasiassa tuman kromosomeissa. DNA-molekyylit ovat solukalvon ja tumakotelon sisällä tiiviissä paketissa, joten DNA:n käsittelyä varten kudokset ja solut rikotaan mekaanisesti ja solujen lipideistä koostuvat rakenteet, kuten solukalvo ja tumakotelo, hajotetaan kemiallisesti. Tähän käytetään yleensä saippuan kaltaisia polaarisia liuottimia.
Tumallisten eliöiden DNA on sitoutuneena kromosomeissa histoniproteiineihin, jotka hajotetaan proteaasientsyymien avulla.
15
Q
DNA:n puhdistaminen
A
Puhdistuksessa käytetyt menetelmät riippuvat sekä tutkittavasta näytteestä että siitä, mihin tarkoitukseen eristettyä DNA:ta tarvitaan. Bakteerien ja arkeonien solulimassa oleva DNA saadaan puhdistettua soluista, kun rikotaan kemikaaleilla ja kuumennuksella solujen soluseinä ja mahdollinen kapseli. histoniproteiinien hajottamisen jälkeen soluissa olevat lipidit ja hajotettujen proteiinien jäänteet puhdistetaan pois. Sitten puhdas DNA saadaan erotettua liuoksesta, kun se sakkautetaan alkoholilla.
16
Q
millä kahdella tavalla DNA:ta voidaan monistaa?
A
Ensimmäisessä monistettava DNA:n pätkä siirretään osaksi bakteeriplasmidia, jolloin se monistuu, kun bakteerit jakaantuvat. Toisessa vaihtoehdossa monistaminen on erittäin tehokasta, ja se tehdään koeputkessa käyttämällä polymeraasiketjureaktiota eli PCR-tekniikkaa.
17
Q
PCR-tekniikka
A
perustuu kuumien lähteiden bakteereista eristetyn DNA-polymeraasientsyymin käyttöön. entsyymi kykenee rakentamaan uutta DNA-juostetta mallina olevan juosteen mukaan hyvin korkeissa lämpötiloissa ilman että lämpötila hajottaa entsyymin rakenteen. Kahden alukkeen avulla saadaan rajattua monistettava alue, kun toinen alukkeista tarttuu toiseen päähän rajattavaa aluetta ja toinen toiseen päähän.
18
Q
mitä PCR-tekniikkaan tarvitaan?
A
DNA-nukleotideja uuden juosteen rakennusaineiksi sekä alukkeita, joihin DNA-polymeraasi kykenee tarttumaan. DNA-polymeraasi, puhdistettu DNA-näyte, puskuriliuos, PCR-putki, PCR-laite
19
Q
aluke
A
lyhyt yksijuosteinen DNA:n pätkä, joka tunnistaa emäspariperiaatteen perusteella monistettavasta DNA:sta tarkasti halutun kohdan. PCR-tekniikassa alukkeina käytetään DNA:ta, koska näin PCR:n tuloksena saadaan pelkästä DNA:sta koostuvia PCR-tuotteita. Lisäksi DNA-alukkeet ovat RNA:ta kestävämpiä. Tutkijat voivat tilata tutkimuksiinsa sopivia alukkeita, kun tunnetaan ainakin osa monistettavan DNA-pätkän emäsjärjestyksestä.
20
Q
PCR:n vaihe I
A
Ensimmäisessä vaiheessa lämpötilaa nostetaan niin, että vetysidokset DNA:n kaksoisjuosteessa katkeavat ja monistettavan DNA-alueen kaksoisjuoste aukeaa. Kun DNA-juosteet irtoavat toisistaan, muodostuu kaksi yksijuosteista DNA:ta.
21
Q
PCR:n II vaihe
A
Toisessa vaiheessa lämpötilaa lasketaan ja alukkeet kiinnittyvät monistettavan alueen molempiin päihin. Alukkeet tarjoavat DNA-polymeraasille kiinnittymiskohdat ja rajaavat samalla monistettavan alueen.
22
Q
PCR:n III vaihe
A
Kolmannessa vaiheessa lämpötilaa nostetaan niin, että DNA-polymeraasi aktivoituu ja rakentaa vastinjuosteet DNA-nukleotideista monistettavalle DNA:lle. Kun näitä kolmea vaihetta toistetaan 25–30 kertaa monistettavasta kohteesta saadaan lukuisia DNA-molekyylejä.
23
Q
PCR hyödyt ja haitat
A
PCR on menetelmänä herkkä. Pienikin määrä DNA:ta riittää siihen, että sitä saadaan monistettua, kun DNA on ensin eristetty ja puhdistettu näytteestä. PCR-menetelmä on altis virheille, koska näytteeseen voi joutua vierasta DNA:ta esimerkiksi näytteen ottajasta.
24
Q
bakteerien DNA
A
koostuu lähes yksinomaan geeneistä, ei laajoja geenien ulkopuolisia alueita kuten tumallisen solun DNA:ssa. Bakteerin geenissä on säätelyalue ja eksoneista muodostuva koodaava alue. Ympäristötekijät säätelevät geenien ilmentymistä bakteerisolussa enemmän kuin tumallisessa solussa.
25
operoni
Yhden säätelyalueen ja monen koodaavan alueen muodostamaa kokonaisuutta kutsutaan operoniksi. Useimmat bakteerin tarvitsemat aineet rakennetaan vaiheittain peräkkäisissä kemiallisissa reaktioissa. Jokaista reaktiota varten tarvitaan eri entsyymi, jonka valmistusta ohjaa oma geeni. Reaktiosarjaan kuuluvien geenien koodaavat alueet ovat yleensä ryhmittyneet yhteisen säätelyalueen perään muodostaen operonin. Operonit ovat yksinkertainen ja tehokas tapa tuottaa sopiva määrä reaktiosarjaan tarvittavia entsyymeitä.
26
tumallisen solujen DNA
Geeni muodostuu koodaavasta alueesta, jossa on eksoneita sekä säätelyalueesta. Eksoneissa on proteiinien rakentumiseen tarvittava informaatio. geenissä on eksonien lisäksi introneita, jotka eivät sisällä proteiinien valmistamiseen tarvittavaa informaatiota. Intronit silmukoidaan pois luettaessa geeniä lähetti-RNA:ksi.
27
eksomi
Eksomilla tarkoitetaan eliön perimän kaikkia eksoneita
28
DNA-sekvenssi
DNA:n emäsjärjestys
29
proteiineja koodaavat geenit
sisältävät informaation siitä, mitä aminohappoja syntyvissä proteiineissa on ja missä järjestyksessä ne tulevat valmiiseen proteiiniin. Tästä aminohappojen järjestyksestä muodostuu valmistuvan proteiinin primaarirakenne. Valmiin proteiinin kolmiulotteinen rakenne eli tertiääri- ja kvartaarirakenne vaikuttavat siihen, miten proteiini toimii.
30
proteiinin valmistus tumallisessa solussa
Geenin säätelyaluetta tarvitaan RNA-synteesin alkamiseen, ja tumassa muodostuu ensin esiaste-RNA. Silmukoinnin jälkeen valmis lähetti-RNA siirtyy soluliman tai solulimakalvoston ribosomeille, jossa tapahtuu translaatio. Koska bakteerien geeneissä ei yleensä ole introneita, niiden soluissa ei myöskään tapahdu silmukointia. Osa proteiineista saa lopullisen, toimivan rakenteensa jatkokäsittelyssä, joka tapahtuu solulimakalvostossa ja Golgin laitteessa. Tästä syystä useita tumallisen solun proteiineja ei voi tuottaa bakteereissa, sillä bakteereilta puuttuvat proteiinien käsittelyyn tarvittavat entsyymit ja soluelimet, kuten solulimakalvosto ja Golgin laite.
31
proteiinien muodostus bakteerisolussa
transkriptiossa l-RNA molekyyli rakentuu ilman silmukointivaihetta. translaatio käynnistyy ribosomilla välittömästi sen jälkeen, kun l-RNA on alkanut rakentua. sama l-RNA voidaan lukea monella ribosomilla peräkkäin, joten tiettyä proteiinia saadaan tuotettua tehokkaasti
32
entsyymit
Solujen aineenvaihdunta perustuu entsyymien toimintaan, sillä ne toimivat biokatalyytteinä nopeuttaen soluissa tapahtuvia biokemiallisia reaktioita, eivätkä ne itse muutu reaktioissa. Entsyymin toimintaan vaikuttavat ympäristötekijät. Jos ympäristötekijät eivät ole entsyymin toiminnan kannalta optimaaliset, niiden toiminta hidastuu ja lopulta entsyymin toiminta voi lakata kokonaan kolmiulotteisen rakenteen tuhoutuessa.
33
katkaisu- eli restriktioentsyymi
katkaisee DNA:n tietyn emäsjärjestyksen kohdalta
34
liittäjä- eli ligaasientsyymi
liittävät irrallaan olevat DNA-juosteiden päät toisiinsa
35
Cas-entsyymit
leikkaavat DNA-molekyylin täsmälleen opas-RNA:n osoittamasta kohdasta
36
käänteiskopioijaentsyymit
kopioivat RNA:n emäsjärjestyksen yksijuosteiseksi vastin-DNA:ksi. Kyseinen entsyymi on eristetty retroviruksista, jotka kykenevät muuttamaan oman virus-RNA:nsa kaksijuosteiseksi DNA:ksi, jotta ne voivat lisääntyä isäntäsolussa.
37
proteaasit
hajottavat solun proteiinit DNA:ta puhdistettaessa
38
RNA-nukleaasit
pilkkovat RNA:ta
39
miten DNA pilkotaan pienempiin osiin?
Pilkkomiseen käytetään bakteereista eristettyjä katkaisu- eli restriktioentsyymejä. Geenitutkimusta tekevissä laboratorioissa on käytössä satoja erilaisia katkaisuentsyymejä. Jokainen katkaisuentsyymi on erikoistunut katkaisemaan DNA:ta vain tietyn emäsjärjestyksen kohdalta, joten käytössä olevat entsyymit määräävät DNA:n mahdolliset katkaisukohdat.
40
miten DNA:ta liitetään yhteen?
Geenitekniikassa käytetään yleensä sellaisia katkaisuentsyymejä, joiden tekemään katkaisukohtaan jää muutaman parittoman nukleotidin mittainen yksijuosteinen pää, eräänlainen ”tarrapinta”. Kun DNA:ta pilkotaan paloiksi käyttämällä jokaisessa kohdassa samaa katkaisuentsyymiä, kaikki katkaisukohdat ovat samanlaisia. Ne sopivat täsmälleen toisiinsa ja muodostavat kaksijuosteista DNA:ta tarttuessaan emäspariperiaatteen mukaisesti kiinni toisiinsa. Liitos sinetöidään vielä tietyn ligaasi- eli liittäjäentsyymin avulla, joka muodostaa uudelleen DNA:n sokeri- ja fosfaattiosien väliset sidokset. Näin on mahdollista liittää kahdesta eri solusta tai eliöstä peräisin olevaa DNA:ta toisiinsa.
41
yhdistelmä-DNA-tekniikka
joukko menetelmiä, joissa DNA:ta käsitellään, muokataan, yhdistetään ja siirretään eliöstä toiseen. Vieraan DNA:n siirtäjinä eli vektoreina käytetään plasmideja, bakteriofageja tai jopa keinotekoisia bakteerikromosomeja.
42
miten yhdistelmä-DNA-tekniikka toimii?
Perinteisessä yhdistelmä-DNA-tekniikassa vieraan geenin siirto plasmidiin tapahtuu siten, että sekä siirrettävä geeni että plasmidi leikataan samoilla katkaisuentsyymeillä. Näin plasmidiin syntyy katkos, johon siirrettävä DNA liitetään liittäjäentsyymillä. Plasmidissa on lisäksi liitettynä antibioottiresistenssigeeni, jonka avulla voidaan myöhemmin valikoida plasmidin saaneet bakteerit.
Kun plasmidivektorit ovat valmiita, ne siirretään koeputkessa olevaan bakteeriviljelmään, jossa plasmideja siirtyy osaan bakteereista. Tämän jälkeen viljelmän bakteereja kasvatetaan antibioottimaljoilla, jolloin vain kyseiselle antibiootille resistentit siirtogeeniset bakteerit säilyvät hengissä. Menetelmää kutsutaan antibioottivalinnaksi, ja sen tuloksena voidaan kasvattaa puhdas klooni bakteereista, joihin siirto on onnistunut. Kun nämä bakteerit jakautuvat, myös niihin siirretty geeni monistuu plasmidin mukana.
43
klooni (bakteeri
Maljalla kasvaa pesäkkeitä, jotka kukin on lähtöisin yhdestä bakteerista. Tällainen pesäke ja siitä kasvatettu viljelmä on klooni.
44
mihin cDNA:ta tarvitaan?
Sitä käytetään monissa emäsjärjestyksen tunnistusta vaativissa tekniikoissa, kuten geenien ilmentymisen tutkimisessa tai silloin, kun halutaan siirtää tumallisen eliön geeni bakteeriin ilman introneita esimerkiksi proteiinin tuottamista varten tai kun halutaan tunnistaa RNA-viruksia PCR:n avulla.
45
miten yksijuosteinen vastin-DNA saadaan kaksijuosteiseksi?
Yksijuosteinen vastin-DNA, joka on valmistettu tumallisen eliön geenin siirtoa varten, muutetaan kaksijuosteiseksi DNA-polymeraasin avulla.
46
CRISPR-tekniikka
Sen avulla DNA pystytään katkaisemaan täsmälleen halutusta kohdasta kyseisten katkaisuentsyymien ja ohjuri- eli opas-RNA:n avulla.
47
sekvensointi
DNA:n emäsjärjestyksen selvittäminen, jonka avulla geenin vaihtoehtoisten muotojen eli alleelien tunnistaminen ja genotyypitys eli genotyypin määrittäminen tulevat mahdollisiksi.
48
geelielektroforeesi
DNA-palojen erottelu tapahtuu sähkökentän avulla, ja menetelmää kutsutaan geelielektroforeesiksi.
Fosfaattitukirankansa takia DNA-palat ovat varaukseltaan negatiivisia, ja siksi sähkövirta saa ne liikkumaan geelimäisessä väliaineessa kohti positiivista napaa. Väliaineena toimiva agaroosigeeli muodostaa verkkomaisen rakenteen, joka hidastaa enemmän pitkien palojen liikettä, joten lyhyet palat liikkuvat nopeammin ja etenevät pitemmälle. Lopputuloksena näytteen sisältämät erikokoiset DNA-palat ovat liikkuneet toisistaan erilleen, ja ne erottuvat väliaineessa värjäyksen ansiosta erillisinä raitoina UV-valossa. Näitä raitoja voidaan verrata tunnetun kokoisia DNA-paloja sisältävään vertailunäytteeseen, jolloin näytteen sisältämien DNA-palojen pituus on määritettävissä.
49
mitä elektroforeesin jälkeen voidaan tehdä?
Kun elektroforeesiajo on loppunut, haluttu raita voidaan leikata irti geelistä ja puhdistaa siitä DNA. Sen jälkeen siitä pystytään esimerkiksi selvittämään kyseisen DNA-alueen emäsjärjestys. Elektroforeesin avulla saatuja raitoja voidaan myös vertailla keskenään, ja käyttää saatuja tuloksia muun muassa yksilöntunnistuksessa.
50
kapillaarielektroforeesi
Kapillaarielektrofeerissa käytetään signaalin vastaanottavaa laitetta, joka reagoi väriaineilla merkattuihin DNA-paloihin. Tulos saadaan kulkeutumisnopeutta kuvaavina pylväinä, joiden perusteella tiedetään eri DNA-palojen emäsparien lukumäärä. Kuten geelielektroforeesissa, lyhimmät DNA-palat kulkevat nopeimmin eli ne ovat kuvassa vasemmalla.
51
mitä eri tapoja on alleelin tunnistamiseen?
1) Alleeli tunnistetaan PCR:n ja elektroforeesin avulla, ja se mahdollisesti sekvensoidaan. 2) Alleeli tunnistetaan koettimeksi kutsutun pienen yksijuosteisen DNA-pätkän avulla. 3) Alleeli tunnistetaan käyttämällä sekä PCR:ää että koetinta yhdessä.
52
alleelin tunnistaminen PCR + elektroforeesi
Ensin monistetaan tietty alleeli tai useimmiten pieni alleelin osa alukkeiden avulla. Alleelista tulee tuntea sen emäsjärjestys tai osa siitä, jotta monistettava DNA-jakso voidaan rajata kahden alukkeen avulla. PCR monistaa alukkeiden väliin jäävän DNA-jakson ja se on todettavissa geelielektroforeesilla, mikäli näytteen sisältämässä DNA:ssa on tämä alleeli. Elektroforeesissa käytettyä geeliä tarkastellaan UV-valossa tai automaattisilla lukulaitteilla.
53
koetin
lyhyehkö, yksijuosteinen, tiettyä tarkoitusta varten laboratoriossa tehty DNA:n tai RNA:n pätkä, esimerkiksi tunnettu pätkä etsittävästä tautialleelista. Siihen on liitetty tavallisesti UV-valossa tai värireaktiossa erottuva väriaine, eräänlainen leima.
54
nukleiinihappojen hybridisaatio
Koettimen käyttö perustuu nukleiinihappojen hybridisaatioon eli juosteiden pariutumiseen emäspariperiaatteen mukaisesti. Siksi koetin pariutuu esimerkiksi yksijuosteiseksi tehdyn DNA:n kanssa, jos juosteiden emäsjärjestykset vastaavat toisiaan. Kiinnittyminen voidaan saada näkyviin värireaktiona.
55
DNA-sirut
pieniä, ohuita lasi- tai muovilevyjä, joiden pinnalla on säännöllisissä riveissä jopa satoja tuhansia erilaisia yksijuosteisia koettimia. Jokainen koetin sirulla vastaa yksittäistä alleelia, ja siinä on osa kyseisen alleelin emäsjärjestystä. Jos halutaan esimerkiksi selvittää, onko jollain henkilöllä tiettyjä sairauteen liittyviä alleeleja perimässään, voidaan hänestä eristää DNA:ta, pilkkoa se paloiksi, tehdä DNA kuumentamalla yksijuosteiseksi ja tutkia, pariutuuko näyte tutkittavien alleelien koettimien kanssa. Pariutuminen näkyy siruissa värireaktioina.
56
reaaliaikainen PCR
Alleelit ja tietyt DNA-alueet voidaan tunnistaa reaaliaikaisella PCR-menetelmällä. Uusimmissa reaaliaikaisessa PCR-tunnistusmenetelmässä koeputkeen lisätään monistusta varten tarvittavien alukkeiden lisäksi fluoresoivalla väriaineella varustettu, hyvin spesifinen koetin, joka tunnistaa alukkeiden välissä olevan alueen. Väriaineesta lähtee signaali signaalinlukulaitteelle ja signaalit kyetään lukemaan jo PCRajon aikana. Lisäksi käyttämällä eri väriaineita voidaan useampaa geenialuetta tutkia samanaikaisesti. Näin tunnistus nopeutuu, koska elektroforeesia ei tarvita.
57
reaaliaikaisen PCR:n vaiheet
1. Koeputkeen laitetaan nukleotidien, alukkeiden ja DNA-polymeraasin lisäksi fluerosoivalla väriaineella varustettu koetin, joka tunnistaa alukkeiden välisen kohdan.
2. PCR-ajo suoritetaan normaaliin tapaan lämpötiloja vaihtamalla.
3. Joka kerta kun alukkeiden välinen DNA-jakso monistuu, koetin irtoaa ja siinä oleva väriaine aktivoituu. Samalla väriaine lähettää signaalin signaalinlukulaitteelle.
4. Laite mittaa monistettujen DNA-jaksojen määrää reaaliajassa signaalien perusteella ja piirtää mittauksesta diagrammia. Elektroforeesia ei tarvita.
58
DNA:n sekvensointi
Sekvensointi tapahtuu sekvensointilaitteilla, jotka tunnistavat tutkittavasta näytteestä kaikki emäkset. Laitteen toimintaperiaate yhdistää PCR:n ja elektroforeesin. DNA-näyte katkaistaan paloihin ja sekvensoidaan. DNA-palat järjestellään päällekkäissekvenssin avulla oikeaan järjestykseen.
59
rinnakkaissekvensointi
lukuisten sekvensointireaktioiden toteuttaminen yhdestä näytteestä yhdellä kertaa.Menetelmä perustuu siihen, että tutkittava DNA pilkotaan ensin paloiksi. Tämän jälkeen kaikki palat monistetaan samanaikaisesti PCR:n avulla. Menetelmässä käytetään vastinemästen tunnistamiseen värjättyjä nukleotideja, jotka PCR:n edetessä pariutuvat monistettavan DNA:n kanssa. Automaattiset lukulaitteet kykenevät sitten rekisteröimään näiden värjättyjen nukleotidien pariutumisen näytteessä olevien nukleotidien kanssa.
Menetelmä on hyvin tehokas ja eri palojen päällekkäisten emäsjärjestysten perusteella tietokoneohjelma laittaa palat oikeaan järjestykseen
60
genomitietokanta
Sekvensoinnilla saadaan niin paljon tietoa ihmisen ja muiden lajien perimästä, että tiedot tallennetaan jättimäisiin genomitietokantoihin. Tietokantojen ja bioinformatiikan avulla avulla sekvensoinnista saatua tietoa käytetään alukkeiden ja koettimien valmistamiseen, geenivirheiden etsimiseen ja geenien toiminnan tutkimiseen. sekvensoinnilla saatua tietomäärää voidaan käyttää esimerkiksi geneettisen monimuotoisuuden ja sairauksien mekanismien tuntemiseen. Sen avulla kehitetään uusia diagnosointi- ja hoitomenetelmiä, rokotteita ja saadaan tietoa geenien muokkaamiseen ja geenisiirtojen tekemiseen
61
miksi eliöiden geenejä muokataan ja siirretään?
saadaan informaatiota siitä, miten geenit toimivat ja ilmenevät eri lajeissa. Eliössä voidaan siirretyn geenin avulla saada ilmentymään sellainen ominaisuus, jollaista siinä ei aiemmin ole ollut. Tällainen on esimerkiksi se, kun eliö saadaan tuottamaan vierasta proteiinia. Geeni voidaan myös tehdä toimimattomaksi poistamalla se osittain tai kokonaan. Geeninsiirtoja ja -poistoja sekä näistä saatavaa uutta tietoa hyödynnetään esimerkiksi lääketieteessä, teollisuudessa sekä kasvien ja eläinten jalostuksessa.
62
muuntogeeniset eliöt
eliöt, joiden perimää on muokattu geenitekniikan menetelmin. geenejä voidaan siirtää, poistaa ja yksilön omia geenejä pystytään myös muokkaamaan eli editoimaan. Tällöin geeniin lisätään tai siitä poistetaan osia, jolloin sen emäsjärjestys ja ilmentyminen muuttuvat.
63
siirtogeeninen
Eliö on siirtogeeninen, kun siihen on lisätty jokin uusi geeni tai DNA-sekvenssi. Siirrettävä geeni tai sen osa voi olla peräisin saman lajin toisesta yksilöstä tai toisesta lajista.
64
poistogeeninen eliö
Geeni voidaan tehdä myös täysin toimintakyvyttömäksi, jolloin eliötä kutsutaan poistogeeniseksi.
65
mikä rajoittaa muuntogeenisten kasvien ja eläinten käyttöä?
Muuntogeenisiä kasveja ja eläimiä on jo tuotettu runsaasti, mutta niiden tuottamista ja käyttämistä rajoittavat monet säädökset, eettiset kysymykset ja kustannukset.
66
millaisia muuntogeenisiä eliöitä käytetään?
Sekä tutkimuksessa että teollisuudessa käytetään runsaasti muuntogeenisiä mikrobeja. Bakteerien, homeiden ja hiivojen lisäksi käytetään paljon muuntogeenisiä eläin- ja kasvisoluviljelmiä, sekä ihmisen solu- ja kudosviljelmiä.
67
siirtogeenisen eliön tuottamisen vaiheet
Haluttu geeni on ensin tunnistettava, eristettävä ja leikattava katkaisuentsyymillä. Sitten se mahdollisesti liitetään liittäjäentsyymeillä sopivaan vektoriin, minkä jälkeen se siirretään solun sisään ja varmistetaan, että siirto on onnistunut.
68
siirrettävän geenin tunnistaminen
Muuntogeenisiä eliöitä tehtäessä on ensimmäiseksi määritettävä haluttu ominaisuus ja tunnistettava ominaisuuden ilmentymiseen vaikuttava geeni tai muu DNA-sekvenssi. Tämän jälkeen siirrettävää DNA-aluetta monistetaan PCR:n avulla.
69
geenin siirtäminen
Geeninsiirrossa käytettävä menetelmä riippuu sekä solutyypistä että kohde-eliöstä. Jotta vieras geeni tai esimerkiksi Cas9-entsyymi ja opas-RNA saadaan solun sisään ja sen tumaan, on läpäistävä joko sekä soluseinä että solukalvo, kuten kasvisoluissa tai pelkkä solukalvo, kuten eläinsoluissa.
DNA:n siirtämisessä hyödynnetään DNA-jakson kohdesoluun kuljettavia vektoreita. Ne voivat olla bakteeriplasmideja, muokattuja viruksia tai kokonaisia keinotekoisia bakteerikromosomeja.
70
geenin siirto bakteerisoluihin
Bakteereilla ja sienillä valmistetaan ensin soluja, joiden soluseinä on heikennetty esimerkiksi kemikaaleilla. Tämän jälkeen siirrettävä DNA saadaan solujen sisään joko lyhyen kuumakäsittelyn tai sähkövirran avulla. Sähkövirta lisää hetkellisesti solukalvon läpäisevyyttä, jolloin siirrettävä DNA pääsee soluun. Kasveilla käytetään erityisesti Agrobacteriumbakteerin mahdollistamaa geeninsiirtoa sekä ”geenipyssyä” eli DNA:lla kuorrutettuja kultapartikkeleja, jotka ammutaan soluihin.
71
geenin siirto eläinsoluun
Siirrettäessä geenejä eläinsoluihin käytetään yleensä joko liposomien avulla tehtävää siirtämistä, adenovirus- tai lentivirusvektoreita tai mikroinjektiota.
72
vektorivälitteiset menetelmät
- agrobakteeri
- keinotekoiset bakteerikromosomit
- virusvektorit (adenovirukset tai lentivirukset)
73
suorat menetelmät
- liposomit
- sähkövirta
- partikkelipommitus geenipyssyllä
- mikroinjektio
- lämpökäsittely
74
miksi viruksia käytetään vektoreina?
ne pystyvät luonnostaan tunkeutumaan isäntäeliön soluihin ja liittämään oman perimänsä niiden perimän osaksi. Vektoreina käytetään esimerkiksi adeno- ja lentiviruksia, jotka on tehty lisääntymiskyvyttömiksi ja ovat siksi vaarattomia kohdesoluille. Virusvektorien avulla voidaan siirtää eli kuljettaa geenejä useimpiin tumallisiin soluihin. Virusvektorin perimää muokataan siten, että lisääntymistä ohjaavat geenit korvataan muilla geeneillä. Näin virus vie kohdesoluun vieraat geenit, mutta ei itse pysty lisääntymään solussa. Käytetyn vektorin tyypistä riippuen siirretty geeni voi joko toimia solussa määrätyn ajan tai liittyä pysyvästi osaksi solun perimää. Tällöin se periytyy solusukupolvelta toiselle solujen jakautuessa.
75
mikroinjektio
siirretään useita kopioita haluttua geeniä mikroskoopin avulla erittäin ohuen lasiputken kautta eläimen hedelmöittyneeseen munasoluun, jossa siittiön ja munasolun tumat eli esitumat eivät vielä ole yhtyneet. Siirto tehdään toiseen näistä esitumista, jolloin tumien yhtyessä siirrettävä geeni siirtyy osaksi hedelmöittyneen munasolun perimää. Tämän jälkeen munasolun annetaan jakautua ja muodostaa kasvatusalustalla alkio. Alkio siirretään hormonien avulla valeraskaaksi tehdyn naaraan kohtuun. Jos siirto on onnistunut, alkiosta kasvaa siirtogeeninen jälkeläinen.
76
miksi mikroinjektio on haasteellinen menetelmä?
geeni ei aina liity osaksi munasolun perimää tai se liittyy väärään kohtaan. Geenistä voi myös liittyä jälkeläisen perimään useampi kopio. Geeninsiirron onnistuminen tarkistetaan ottamalla jälkeläisestä DNA-näyte ja testaamalla siirron onnistuminen reaaliaikaisella PCR:llä.
77
sähköimpulssimenetelmä
Eläinsoluja kasvatetaan tutkimustarkoituksiin kudos- ja soluviljelmissä. Kun halutaan siirtää geeni soluviljelmässä oleviin soluihin, voidaan käyttää sähköpulssia, joka helpottaa siirrettävän DNA:n pääsyä solun sisään.
77
geenin siirto liposomin avulla
Myös fosfolipidien muodostamia pieniä kalvorakkuloita, liposomeja, käytetään vieraan DNA:n siirtämiseen eläinsoluviljelmän soluihin. Liposomi, jonka sisällä siirrettävä DNA on, sulautuu solukalvoon ja samalla sen sisältö vapautuu solulimaan tai menee solulimaan ja vapauttaa siellä DNA:n. Siirretty geeni liittyy mahdollisesti tumassa osaksi solun omaa DNA:ta ja siirtyy sitten solunjakautumisten yhteydessä tytärsoluihin.
78
mihin siirtogeenisiä bakteereja tarvitaan?
Siirtogeenisiä bakteereja tehdään yleensä proteiinien tuottamista tai geenien monistamista varten. Bakteerit lisääntyvät suotuisissa oloissa erittäin nopeasti ja tuottavat suuria määriä proteiineja. Niissä on tuotettu lääkkeitä, kuten ihmisen insuliinia ja interferonia, joka osallistuu solujen puolustautumiseen viruksia vastaan. Lisäksi geenien emäsjärjestystä voidaan muokata, jolloin proteiinin rakenne saadaan juuri halutunlaiseksi. Siirtogeenisiä bakteereja käytetään myös monien teollisuuden tarvitsemien proteiinien valmistukseen.
79
mitä ongelmia on tumallisen eliön geenien siirtämisessä bakteereihin?
Tumallisen solun geenit eivät toimi sellaisenaan bakteeriin siirrettyinä, koska ne ovat geneettiseltä koodiltaan joiltain osin erilaisia kuin bakteerin geenit sekä rakenteeltaan ja säätelyltään monimutkaisia. Jos tumallisen eliön geeniä halutaan ilmentää bakteerissa, geenin emäskolmikkokoodi pitää muuttaa vastaamaan bakteerien vastaavaa koodia. Eroja on esimerkiksi lopetuskolmikoissa. Tumallisen eliön geenin proteiinia koodaava alue tarvitsee eteensä myös bakteerissa toimivan säätelyalueen. Bakteereissa tuotetut tumallisen eliön proteiinit eivät aina pysty laskostumaan oikein, eivätkä bakteerit kykene tekemään joidenkin proteiinien vaatimia translaation jälkeisiä muokkauksia, koska niiltä puuttuvat siihen tarvittavat soluelimet, kuten Golgin laite.
80
mitä pitää tehdä kun siirretään tumallinen geeni bakteeriin?
Kun siirrettävä geeni on peräisin tumallisesta solusta, siirtogeeni tehdään aina käänteiskopioijaentsyymin avulla lähetti-RNA:sta vastin-DNA:ksi. Koska suurin osa tumallisen geenin DNA-sekvenssistä on intronijaksoja, cDNA:n käyttö siirtogeeninä on paljon helpompaa kuin koko geenisekvenssin riippumatta siitä, siirretäänkö geeni bakteeriin tai tumalliseen eliöön. Samalla vältytään lähetti-RNA:n silmukoimiseen liittyviltä ongelmilta. Bakteerit eivät pysty poistamaan introneita
81
agrobakteerin käyttö vektorina
Kasveihin tehtävän geeninsiirron vektorina käytetään tavallisesti agrobakteereja. Agrobakteerissa on vektoriksi sopiva plasmidi, jonka tietty osa siirtyy luonnossa osaksi isäntäkasvin kromosomia ja aiheuttaa kasveille kasvannaisia, äkämiä. Geeninsiirtoa varten agrobakteerin plasmidia muokataan kuitenkin siten, että äkämien muodostuminen estyy. Plasmidiin siirretään haluttu geeni säätelyalueineen, ja yhdistelmäplasmidi siirretään takaisin agrobakteeriin. Tämän jälkeen bakteerien annetaan infektoida kasvatusmaljalla kasvisoluja, joista siirron onnistuessa kasvaa siirtogeeninen kasvi. kasvisoluun on tehty tätä varten mekaaninen vaurio
82
ongelmat agrobakteerin käytössä vektorina?
Agrobakteerin käyttöä vektorina haittaa se, ettei voida etukäteen tietää, onnistuuko siirto oikeaan kohtaan kasvin genomia tai onnistutaanko siinä lainkaan. Onnistuneen siirron osoittamiseen käytetään usein plasmidiin liitettyä merkkigeeniä, jonka avulla kasvisolut saadaan vastustuskykyisiksi jollekin rikkakasvimyrkylle. Tämä mahdollistaa myrkyn avulla tehtävän valinnan eli ne kasvit, joihin siirto on onnistunut, kestävät myrkkykäsittelyn. Vaihtoehtoisesti bakteerien tapaan myös kasvisoluihin voidaan siirtää geeni, joka antaa vastustuskyvyn tietyille antibiooteille. Näin voidaan kasveillakin käyttää onnistuneiden siirtojen toteamisessa antibioottivalintaa, jolloin antibiootit estävät kasvien viherhiukkasten kehittymisen niissä kasveissa, joihin geeni ei ole siirtynyt
83
geenipyssyn käyttö
Kun geenejä siirretään kasveihin, voidaan käyttää geenipyssyksi kutsuttua laitetta. Sillä ammutaan kasviin DNA:lla päällystettyjä kultahiukkasia, jotka tunkeutuvat soluihin. Sattumanvaraisesti osa hiukkasten pinnalla olevasta DNA:sta liittyy kasvin kromosomiin. Kultahiukkaset ovat käyttökelpoisia geenipyssyssä, koska ne ovat painavia, ja siitä syystä ne on helppo ampua soluihin. Ne eivät myöskään reagoi helposti solun muiden molekyylien kanssa.
84
missä eläinproteiineja tuotetaan?
niitä tuotetaan usein hiivassa. Hiiva on sieni eli tumallinen eliö, mutta bakteerien tapaan se on nopeasti ja helposti kasvatettava. Hiivassa valmistetaan esimerkiksi ihmisen insuliinia ja kasvuhormonia. Toisin kuin yleensä tumallisilla eliöillä, hiivasoluissa on plasmideja, jotka muistuttavat bakteerien plasmideja. Niitä käytetään bakteerin plasmidien tapaan tehokkaina vektoreina.
85
muuntogeeniset eläimet tutkimuksissa
muuntogeenisiä hiiriä ja muita eläimiä käytetään laajasti bio- ja lääketieteellisissä perustutkimuksissa. Tutkijat voivat tehdä muuntogeenisen hiiren itse tai ostaa tämän tähän erikoistuneelta yritykseltä. Tutkimuskäyttöön kehitettyjä muuntogeenisiä hiirilinjoja pidetään yllä pakastettuina alkioina tai siittiöinä useissa laboratorioissa, joista tutkijat pystyvät tilaamaan niitä käyttöönsä.
86
miten siirtogeenisiä hiiriä voidaan tuottaa mikroinjektion ja virusvektorien lisäksi?
alkion kantasolujen avulla. siirrettävä geeni liitetään vektoriin ja DNA siirretään soluihin kantasoluviljelmässä. kasvatusalustalta valitaan solut, joihin siirto onnistui ja ne siirretään varhaiseen alkioon. valeraskaan naaraan kohtuun. risteytetään yksilöitä, jotta saadaan siirtogeenin suhteen homotsygoottinen kanta
87
miten varmistetaan, onnistuiko siirtogeenisen hiiren valmistus?
Siirrettävän geenin yhteyteen liitetään usein merkkigeeni, jonka avulla on helppo havaita geeninsiirron onnistuminen. Esimerkiksi hiiriin siirretään varsinaisen siirtogeenin lisäksi merkkigeeni, jonka koodaamana syntyvä proteiini saa hiiret hohtamaan eri värisenä UV-valossa. Yleisesti käytetään myös siirtogeenisiä kudoksia värjääviä entsyymejä. Geenin ilmentyminen voidaan varmistaa myös sillä, syntyykö solussa lähetti-RNA:ta. Sen tunnistamisessa käytetään joko PCR-menetelmää tai värjättyä koetinta, joka pariutuu emäspariperiaatteen mukaisesti solusta eristetyn lähetti-RNA:n kanssa.
88
poistogeenisen hiiren tuottaminen
Yleisin tapa tuottaa poistogeenisiä hiiriä on tehdä geeni toimimattomaksi alkion kantasoluviljelmässä. Kantasoluviljelmässä virheellisillä geeneillä korvataan kantasoluissa normaalisti toimivat geenit. Näin syntyneitä poistogeenisiä alkion kantasoluja ruiskutetaan normaaleihin alkioihin. Osa poistogeenisistä soluista päätyy alkioista syntyvien hiirten sukusolulinjoihin. Kun jälkeläisiä risteytetään, osa seuraavan sukupolven yksilöistä on poistogeenisiä. Menetelmän käyttöä muilla eläimillä rajoittaa se, että jostain syystä viljellyt kantasolut eivät päädy sukusolulinjaan yhtä usein kuin hiirillä.
Koska geenin tekeminen toimimattomaksi on usein haitallista, poistogeenisiä eläinkantoja pidetään laboratorioissa yllä kasvattamalla heterotsygoottisia yksilöitä. Kun geenin vaikutusta halutaan tutkia, näitä heterotsygoottisia yksilöitä risteytetään, jolloin saadaan poistogeenin suhteen homotsygoottisia yksilöitä
89
CRISPR-menetelmän käyttö muuntogeenisissä eliöissä
1) kun halutaan muokata eliön omia nukleotideja eli korjata esimerkiksi viallinen geeni, jolloin tuotetaan tiettyyn kohtaan pistemutaatio 2) kun halutaan siirtää eliöön lyhyehkö pätkä DNA:ta tai 3) kun halutaan tehdä jokin geeni toimimattomaksi eli tuotetaan poistogeenisiä eliöitä. Aikaisempiin geenimuokkausmenetelmiin verrattuna tekniikka on yksinkertaisempi, helpompi ja halvempi, sillä se ei vaadi kantasolujen kautta tapahtuvaa muokkausta, vaan muokkaus voidaan tehdä suoraan hedelmöittyneelle munasolulle.
90
CRISPR-tekniikan toiminta
CRISPR-tekniikassa Cas-entsyymiin liitetään tietyn emäsjärjestyksen tunnistava RNA:n pätkä, opas-RNA, joka tunnistaa DNA:sta halutun kohdan emäspariperiaatteen mukaisesti. Cas-entsyymi katkaisee juosteen opas-RNA:n määräämässä paikassa, minkä jälkeen solu hyödyntää luonnollisia DNA:n korjausmekanismeja juosteen korjaamiseen. Kun vaurioita korjataan, solussa syntyy satunnaisia mutaatioita. Sen seurauksena kyseisessä kohdassa oleva geeni muuttuu toimintakyvyttömäksi eli tuloksena on poistogeenisyys. Tekniikalla kyetään poistamaan yksittäisiä emäksiä tai lyhyehköjä DNA:n pätkiä erittäin tarkasti.
CRISPR-tekniikkaa hyväksi käyttäen saadaan myös lisättyä vierasta DNA:ta osaksi muokattavaa DNA-ketjua.
91
primetekniikka
CRISPR-Cas-tekniikassa leikataan auki DNA:n molemmat juosteet, mutta uusi menetelmä eli primetekniikka katkaisee vain toisen juosteen. Tämä menetelmä on tarkempi kuin aiemmat editointimenetelmät. Prime-tekniikalla voidaan kuitenkin korjata vain lyhyitä DNA-alueita.
92
CRISPR-Cas9-menetelmä
Kun opas-RNA saapuu DNA:lle, DNA-juoste avautuu PAM-sekvenssin kohdalta. Jos opas- RNA ei ole tuohon kohtaan sopiva, DNA sulkeutuu takaisin. PAM-sekvenssin avulla opas- RNA voidaan ohjata tarkasti oikealle paikalle. Opas-RNA tunnistaa kohteena olevan DNA-jakson ja Cas-entsyymi katkaisee DNA:n molemmat juosteet opas-RNA:n määräämästä kohdasta. Koska CRISPR-tekniikkaa voidaan käyttää sekä poistogeenisten eliöiden tuottamiseen että haluttujen geenien muokkaamiseen, tekniikalla on useita sovelluskohteita.
93
poistogeenisen hiiren tuottaminen CRISPR-tekniikalla
1. syntetisoidaan opas-RNA, joka pariutuu toimintakyvyttömäksi tehtävän geenin DNA:n kanssa emäspariperiaatteen mukaisesti.
2. Opas-RNA liitetään Cas-entsyymiin.
3. Hormonikäsitelty naarashiiri saatetaan raskaaksi ja hedelmöityneet munasolut kerätään talteen.
4. Opas-RNA:lla varustettu Cas-entsyymi siirretään kasvatusmaljalla hedelmöittyneisiin munasoluihin sähköpulssin avulla. Solu pyrkii korjaamaan katkaisukohdan, jolloin alkuperäisestä geenisekvenssistä poistetaan lyhyt osa. Mikäli osan mukana poistuu aloituskolmikko tai kun geenin lukukehys muuttuu, geeni ei enää toimi.
5.Munasolut siirretään valeraskaaseen hiireen.
6. Jälkeläisistä valitaan ne poikaset, joihin siirto on onnistunut. Tämä tapahtuu eristämällä kohdegeeni PCR:llä ja sekvensoimalla se. Usein siirron yhteydessä munasoluun laitetaan myös geeni, joka aiheuttaa esimerkiksi karvaan valkoisen värin. Näin poistogeenisten jälkeläisten tunnistaminen helpottuu.
7. Valituista hiiristä kasvatetaan poistogeenin suhteen homotsygoottinen hiirikanta
94
kloonaaminen
perimältään samanlaisten yksilöiden tuottaminen. Tutkimusta varten voidaan kloonata myös geenejä tai soluja.
95
solukkoviljely
Kasvin varren ja juuren kärjen kasvupisteistä otetut solut pystyvät erilaistumaan eri solukoiksi. Myös lehden soluista saadaan erilaistettua uudelleen kokonaisia kasveja. Siksi kasveja voidaan kasvattaa nopeasti ja helposti solukkoviljelyn avulla. Kasvista otetaan pieni määrä soluja, jotka laitetaan kasvamaan kasvatusalustalle. Kasvatusalustalla on solujen kasvua varten glukoosia, ravinteita sekä kasvihormoneja. Solut alkavat jakautua, ja ne saadaan kasvihormonien avulla erilaistumaan taimiksi.
Solukkoviljelyn avulla kasvatetut kasvit ovat perimältään samanlaisia kuin emokasvi, eli ne ovat sen klooneja. Näin saadaan kasvatettua nopeasti suuri määrä kasviyksilöitä, joilla on jokin toivottu ominaisuus
96
kasvihormonit
Kasvien yksilönkehitykseen vaikuttavat kasvihormonit. Ne ovat kasvien tietyissä osissa syntyviä yhdisteitä, jotka leviävät yleensä veteen liuenneina eri puolille kasvia. Kasvihormonit vaikuttavat hyvin pieninä pitoisuuksina kohdesolujensa toimintaan. Ne ohjaavat yhdessä ympäristötekijöiden kanssa solujen aineenvaihduntaa ja kasvien kehitystä. Solukkoviljelyn eri vaiheissa käytetään eri kasvihormoneja. Niiden avulla solut saadaan erilaistumaan eri solukoiksi sekä taimet juurtumaan kasvualustaan.
97
tumansiirtotekniikka
menetelmä, jossa luovuttajan hedelmöittymättömästä munasolusta poistetaan tuma. Sen jälkeen munasoluun siirretään tuman tilalle kloonattavan yksilön erilaistuneen solun tuma. Klooniin eivät siirry kloonattavan yksilön solun mitokondriot ja niissä sijaitsevat geenit, vaan ne ovat peräisin siltä yksilöltä, jolta munasolu on otettu. Tumansiirron jälkeen munasolu aktivoidaan jakautumaan kuin hedelmöittynyt munasolu, ja se erilaistuu kuin alkio. Alkio siirretään kasvamaan sijaisemon kohtuun, ja syntyvä uusi yksilö on tuman geenien osalta samanlainen kuin tuman luovuttanut yksilö. Kloonaaminen voidaan toteuttaa myös siten, että kloonattavan eläimen ihosolu sulautetaan sähkövirran avulla luovuttajan munasoluun.
98
miksi tumansiirtotekniikkaa ei enää juurikaan käytetä?
Kloonatuissa eläimissä esiintyi paljon kuolleisuutta jo alkiovaiheessa, ja enintään muutama prosentti alkioista kehittyy normaalisti. Tämä johtuu siitä, että siirrossa käytettyjen somaattisten solujen tumien perimässä on epigeneettisiä muutoksia, jotka vaikuttavat eläimen normaaliin kehittymiseen.
99
miten eläimiä kloonataan nykyään?
eläin kloonataan kantasoluja hyödyntäen. Kantasolut voivat erilaistua kaikiksi muiksi solutyypeiksi ja siten ne muistuttavat alkion normaaleja soluja. Geenitekniikan keinoin lähes mikä tahansa jakautuva solutyyppi, yleisimmin kuitenkin sidekudossolu, voidaan uudelleenohjelmoida kantasoluksi. Kloonauksessa käytettäviä kantasoluja voidaan myös eristää esimerkiksi eläimen rasvakudoksesta. Kantasolu siirretään sellaisenaan munasoluun, jonka tuma on poistettu ja alkionkehitys käynnistetään kemiallisesti. Kantasolujen kautta kloonatut eläimet ovat normaaleja, mutta niiden tutkimuskäyttö on vähäistä.
100
biometrinen tunnistus
biologisiin ominaisuuksiin perustuva tunnistus. pyritään mittaamaan biologiset ominaisuudet niin tarkasti, että yksilö pystytään tunnistamaan riittävällä varmuudella.
101
sormenjälkien käyttö
Sormenjälkien käyttö yksilöntunnistuksessa perustuu siihen, että sormien ihoharjanteet ovat yksilöllisiä. Identtisten kaksostenkin sormenjäljet eroavat toisistaan sen verran, että niiden perusteella heidät pystytään erottamaan toisistaan. Geenien lisäksi erot sormenjäljissä selittyvät sillä, että sormenpäiden pintakuvioinnin säätelyyn vaikuttavat kohdun ympäristötekijät, kuten ravintoaineet. Sormenpäiden ihoharjanteiden perustyypit ovat kaaret, silmukat ja kierteet.
102
tunnistus iiriksen avulla
Kullakin ihmisellä on myös omanlaisensa kuviointi silmän värikalvossa eli iiriksessä. Kuten sormenjäljissäkin, kuviointi on erilainen identtisillä kaksosillakin. Iiriksen kuviointi ei juurikaan muutu iän myötä. Iiristunnistuksessa iirikseen kohdistetaan infrapunavaloa ja se kuvataan infrapunakameralla. Iiristunnistus on tarkka ja iiriksen kuviointia on lähes mahdotonta väärentää tai jäljitellä.
103
kasvontunnistus
Kasvontunnistuksessa silmän, nenän ja suun mittasuhteet ja muodot analysoidaan tekoälyn avulla yksilölliseksi kasvokartaksi, jota verrataan joko henkilön oikeisiin kasvoihin tai erilaista tietokannoista löytyviin kasvokuviin
104
biopassi
biopassissa eli biometrisessä passissa on nuppineulanpään kokoinen mikrosiru, johon on tallennettu digitaaliset henkilötiedot, nimikirjoitus, kasvokuva sekä sormenjälki. Digitaalisen informaation ansiosta passia on vaikea väärentää.
105
DNA-tunnistus
tarvitaan tunnistettavasta henkilöstä otettu DNA-näyte sekä DNA-näyte, johon tunnistettavaa näytettä verrataan. DNA-tunnistuksessa käytetään geenien ulkopuolisia DNA:n lyhyitä toistojaksoja. Eri yksilöillä näitä toistoja on eri määrä, ja näin muodostuu eri mittaisia toistojaksoalueita. Alueiden pituutta vertaamalla yksilöt erotetaan toisistaan. Toistojaksoja monistetaan PCR-menetelmällä, jota varten tarvitaan kunkin toistojakson alun ja lopun tunnistavia alukkeita. Monistetut toistojaksot erotellaan elektroforeesissa. Eripituisista DNApätkistä muodostuu kullekin henkilölle yksilöllinen koodi, DNA-tunniste eli DNA-profiili.
106
miksi edes identtisten kaksosten DNA ei ole täysin samanlaista?
Erot johtuvat DNA:ssa tapahtuneista mutaatioista. Identtisillä kaksosilla on samat DNA-toistojaksot. Heidät voidaan erottaa toisistaan koko genomin sekvensoinnilla.
107
miksi DNA-tunnistus ei anna tietoa yksilön ominaisuuksista?
toistojaksot sijaitsevat geenien ulkopuolisella ei-koodaavalla alueella
108
isyystutkimus
lapsen toistojaksoihin perustuvaa DNA-tunnistetta verrataan äidin ja mahdollisen isän DNA-tunnisteisiin. Ne DNA:n toistojaksot, joita äidillä ei ole, pitäisi löytyä isältä. Jos lapselta löytyy äidin toistojaksojen lisäksi useampia sellaisia toistojaksoja, joita isäehdokkaalla ei ole, on todennäköistä, että hän ei ole lapsen isä.
109
fenotyyppitutkimukset
tehdään DNA-näytteistä, perustuvat sekvensointiin. oikeuslääketieteellinen DNA-fenotyypitys. Fenotyyppitutkimuksilla saadaan todennäköisyyksiä joidenkin yksilön näkyvien ominaisuuksien ilmentymiselle. Tällaisia ominaisuuksia ovat esimerkiksi silmien, hiusten ja ihon väri sekä kasvojen muoto. tavoitteena saada tietoa siitä, miltä henkilö näyttää. Fenotyyppitietojen perusteella on pystytty mallintamaan tutkittavan henkilön kasvot. Myös henkilön esivanhempien geneettinen alkuperä on mahdollista selvittää DNA-tutkimuksella
110
geneettinen sukututkimus
sukulaisuussuhteita selvitetään DNA-testeillä, jotka perustuvat tiettyjen DNA-jaksojen rinnakkaissekvensointiin. yleisimmät sukututkimuksissa käytetyt DNA-testit ovat Y-kromosomista tehtävä Y-DNA-testi eli isälinjan tutkimus, mtDNA-testi eli mitokondrioiden DNA:sta tehtävä äitilinjan testi sekä autosomaalinen DNA-testi. Testien tulokset kertovat yksilöille yhteisen DNA:n määrän, jonka perusteella voi päätellä sukulaissuhteen läheisyyttä.
111
mistä suurin osa ihmisten välisistä perinnöllisistä eroista johtuu?
yhden nukleotidin muutoksista eli snipeistä
112
DNA-viivakoodi
Lajien tunnistukseen sopivat parhaiten evoluutiossa tasaisella nopeudella muuttuneet DNAjaksot. Eläimillä tällaisia ovat esimerkiksi mitokondrioiden geenien tietyt DNA-jaksot. Kyseisistä jaksoista selvitetään sekvensoinnin avulla emäsjärjestys, ja näin saadaan lajille ominainen DNA-viivakoodi. Jokainen väriviiva kuvaa tiettyä emästä sekvenssissä.
113
ympäristö-DNA
Maasta, ilmasta ja vedestä löytyy paljon eri eliöiden DNA:ta, jota kutsutaan ympäristö-DNA:ksi
114
miten DNA-viivakoodit nopeuttavat lajien luokittelua?
Monien lajien erottaminen toisistaan pelkästään ulkoisten ominaisuuksien perusteella on mahdotonta. DNA-viivakoodien avulla on pystytty erottaman toisistaan lajeja, joita aikaisemmin on pidetty samaan lajiin kuuluvina. DNA-viivakoodin avulla lajien tunnistaminen on mahdollista kaikissa hyönteisten kehitysvaiheissa ja jopa rikkoutuneista näytteistä.
115
fylogeneettiset sukupuut
DNA-viivakoodien käyttö helpottaa ja nopeuttaa eliöiden luokittelua, koska niiden avulla voidaan vertailla perimän eroja ja samankaltaisuuksia. Mitä suurempi ero on, sitä aikaisemmin lajit ovat erkaantuneet yhteisestä kantamuodosta. Näin saadaan selvitettyä eliöryhmien ja -lajien sukulaissuhteita sekä evolutiivista kehityshistoriaa, joita kuvataan fylogeneettisten sukupuiden avulla.
116
miten eläimiin ja kasveihin kohdistuvaa rikollisuutta voidaan paljastaa DNA-viivakoodeilla?
esim. salametsästetyn eläimen alkuperän selvitys, kasvilajikkeiden sekä huumekasvien tai niiden siementen tunnistamisessa. ruokaväärennökset
117
diagnoosi
Sairauksien hoito perustuu diagnoosiin eli päättelyyn taudin aiheuttajasta. Päättely perustuu potilaan oireisiin sekä erilaisista laboratoriokokeista ja kuvantamisesta saatuihin tietoihin. Biotekniikan avulla kehitetään eri potilaille yhä henkilökohtaisempia hoitoja.
118
tautien syyt
Jotta tauteja voidaan ehkäistä, diagnosoida ja hoitaa, niiden syntymekanismit ja vaikutukset pitää tuntea mahdollisimman hyvin. Epäterveelliset elämäntavat ovat useiden tautien syinä, mutta monien tautien taustalla ovat useissa geeneissä tapahtuneet mutaatiot ja niiden yhteisvaikutus.
119
tautimallit
Koe-eläimissä mallinnetaan ihmisillä esiintyviä tauteja ja niihin kehitetään uusia hoitokeinoja. Soluviljelmiin verrattuna eläinten käyttämisessä tautimalleina on etuna se, että esimerkiksi perinnöllisiä sairauksia ja syöpäkasvaimia pystytään tutkimaan olosuhteissa, jotka vastaavat mahdollisimman hyvin potilaan elimistöä. eniten tautimalleina käytetään hiiriä. Sika sopii kuitenkin usein hiirtä paremmin tautimalliksi ihmisten taudeille, sillä sen elintoiminnot ovat samankaltaisemmat ihmisen elintoimintojen kanssa.
120
tautimallien eettiset ongelmat
Nisäkkäitä käytetään lääketieteellisessä tutkimuksessa ainoastaan silloin, kun ne eivät ole korvattavissa muilla eliöillä tai esimerkiksi soluviljelmillä. Lainsäädännön ja valvonnan avulla pyritään huolehtimaan siitä, että eläimille ei aiheuteta tarpeetonta kipua ja kärsimystä.
121
geenien aktiivisuuden selvittäminen
Joskus on tarpeellista tietää, mitkä geenit ovat aktiivisia tietyissä kudoksissa tai kuinka aktiivisesti ne toimivat. Esimerkiksi syöpäsolujen nopeaa kasvua edistävät geenit ovat terveidenkin solujen toiminnan kannalta tarpeellisia geenejä, koska ne säätelevät solujen jakautumista ja hengissä pysymistä. Syöpäsoluissa ne toimivat kuitenkin liian tehokkaasti. Näiden geenien aktiivisuutta voidaan selvittää DNA-siruilla.
Geenien aktiivisuuden selvittäminen alkaa eristämällä tutkittavasta kudoksesta lähetti-RNA:ta, koska sitä syntyy geenien ilmentymisen tuloksena. Tästä RNA:sta tehdään käänteiskopioinnilla lyhyitä yksijuosteisia vastin-DNA-pätkiä, jotka värjätään tunnistamista varten. Aina kun tutkittava pätkä pariutuu sirun jonkin tutkittavan geenin koettimeen, tiedetään, että tutkittavassa kudoksessa kyseinen geeni on aktiivinen. Näin on mahdollista esimerkiksi vertailla, mitkä geenit ovat aktiivisia syöpäkudoksessa ja mitkä geenit sitä ympäröivässä terveessä kudoksessa. Merkkiaineen synnyttämän värireaktion avulla skannerilla luetaan, missä kudoksissa mikin geeni ilmentyy. Värireaktion voimakkuus puolestaan kertoo, kuinka aktiivisesti geenit toimivat.
122
miten selvitetään, missä kudoksissa joku geeni on toiminnassa?
Kun halutaan selvittää, missä kudoksissa jokin geeni on toiminnassa, käytetään lähetti-RNA:n tunnistavaa koetinta. Koetin on lyhyehkö yksijuosteinen laboratoriossa valmistettu DNA:n pätkä, johon liitetään UV-valossa tai värireaktiona erottuva merkkiaine, eräänlainen leima. Esimerkiksi fluoresoivat merkkiaineet tarttuvat solujen l-RNA molekyyleihin ja ne erottuvat, kun kudoksia tarkastellaan mikroskoopilla.
123
geenikirjasto
Bakteerit sopivat hyvin eliöiden geenien tai koko perimän, genomin, säilytyspaikaksi. Bakteeriviljelmään siirrettyä jonkin eliön perimää tai osaa siitä sanotaan geenikirjastoksi.
124
miten geenikirjastoja tehdään?
Siirto tehdään yhdistelmä-DNA-tekniikalla. Bakteerit lisääntyvät jakautumalla nopeasti sopivissa kasvatusolosuhteissa. Ennen jakaantumista bakteerin kromosomissa ja plasmideissa oleva DNA kahdentuu, jolloin myös niihin siirretty vieras DNA monistuu eli kloonautuu.
125
ihmisen genomin tallentaminen bakteereihin
. Kun bakteeriviljelmään halutaan tallentaa esimerkiksi ihmisen genomi, niin ihmisen DNA eristetään, pilkotaan sopivan mittaisiksi paloiksi ja palat liitetään liittäjäentsyymin avulla osaksi samalla katkaisuentsyymillä käsiteltyä plasmidia. Plasmidit siirtyvät kasvatusmaljalla bakteereihin ja siirron onnistuminen tarkistetaan antibioottivalinnalla. . Tämän kaltaista kirjastoa tarvitaan, kun tutkitaan geenin koodaavien alueiden ulkopuolisia alueita.
126
eksomikirjasto
sisältää pelkät geenien eksonit ilman introneita, säätelyalueita ja geenien ulkopuolisia alueita. Tällöin eristetään tutkittavan kudoksen soluista kaikki lähetti-RNA:t ja muokataan niistä käänteiskopioijaentsyymin avulla vastin-DNA:t, joille tehdään vastinjuosteet DNA-polymeraasin avulla. Tämän jälkeen kaksijuosteiset, vain eksoneita sisältävät DNA-pätkät liitetään bakteerin plasmideihin, jotka siirretään bakteereihin. Kustakin kudoksesta muodostuu erilainen eksomikirjasto, koska jokaisessa kudoksessa ilmentyvät eri geenit. Esimerkiksi maksan aktiivisista geeneistä muodostuu maksan geenikirjasto ja hermostossa toimivista geeneistä hermogeenikirjasto. Eksomikirjastoja tehdään, kun halutaan tutkia aktiivisia geenejä normaalissa kudoksessa. Niitä verrataan esimerkiksi saman kudoksen syöpäkasvaimessa aktiivisiin geeneihin.
127
genomitietokanta
Genomitietokantoihin on tallennettu runsaasti ympäri maailmaa kerättyä sekvenssitietoa ihmisen perimästä lääketieteellistä tutkimusta varten
128
bioinformatiikka
Kun tutkitaan ihmisen koko perimää yksittäisten geenien sijasta, voidaan tutkia monien alleelien yhteisvaikutusta tautien synnyssä. Samaa tautia sairastavista eri potilaista löytyy tautiin vaikuttavia eri geenien alleeleita. Tätä tietoa analysoidaan tilastollisin menetelmin bioinformatiikan avulla. Tallennettua genomitietoa käytetään muun muassa laktoosi- intoleranssin diagnoosissa
129
biopankit
biopankkeihin varastoidaan kudos- ja DNA-näytteiden lisäksi esimerkiksi kyselylomakkeilla kerättyjä potilastietoja. Kun näitä potilaan sairaudesta ja elämäntavoista saatavia tietoja yhdistetään geenitietoon, on mahdollista selvittää sairauksien syntymekanismeja.
130
geenitesti
selvitetään perimässä olevaa DNA-virhettä tai alttiutta sairastua tiettyyn tautiin. Niiden avulla etsitään perinnöllisiä sairauksia, tunnistetaan taudin oireettomia kantajia ja selvitetään vanhempien riskejä saada sairas lapsi. Suomessa on käytössä DNA-siru, jonka avulla tutkittavalta henkilöltä voidaan samalla kertaa testata useita satoja yhden geenin aiheuttamia periytyviä tauteja.
131
geenipaneeli
Se, mitkä alleelit ovat aiheuttaneet potilaan sairastumisen, on mahdollista selvittää geenipaneelien avulla. Geenipaneeliin on valittuna jopa tuhansia geenejä, joiden tiedetään liittyvän tutkittavaan tautiin. Potilaasta otetaan näyte, jonka DNA:n emäsjärjestys selvitetään paneelilla käyttäen kohdennettua rinnakkaissekvensointia. Potilaan geenien sekvenssejä vertaillaan vertailutietokantoihin, ja tiedon avulla selviää, minkälainen mutaatio potilaalla on tautigeenistä tai -geeneistä. Näiden tietojen avulla pystytään tunnistamaan myös taudin tyyppi ja tarvittaessa räätälöimään heille paras mahdollinen yksilöllinen hoito.
132
mitä jos henkilöllä on harvinainen sairaus, jonka diagnoosi on vaikea tehdä ja jolle ei löydy valmista geenipaneelia?
voidaan sekvensoida hänen kaikkien geeniensä eksonit. Tämän jälkeen niitä verrataan terveiden henkilöiden vastaaviin ja tutkitaan, mitä mutaatioita potilaan eksoneista löytyy. Mikäli halutaan lisäksi tutkia geenien välissä olevia säätelyalueita, on mahdollista sekvensoida potilaan genomi. Molemmissa tapauksissa tutkimuksista saatava informaation määrä on valtava ja sen tulkitseminen on vaikeaa. Tähän tarvitaan avuksi bioinformatiikkaa ja yhä enemmän tekoälyä
133
sikiödiagnostiikka
Sikiödiagnostiikassa etsittiin pitkään muutoksia kromosomien rakenteessa ja määrissä tai yksittäisissä geeneissä istukkanäyte- ja lapsivesitutkimuksien avulla. Nykyisin seulonta perustuu äidin veren raskaus- ja istukkaproteiinien mittauksiin sekä sikiön ultraäänitutkimuksiin. Osa tässä seulassa epäillyistä tapauksista ei todellisuudessa johdu trisomiasta. Sellaisissa tilanteissa tehdään uusi ultraäänitutkimus ja otetaan tarvittaessa lapsivesinäyte. Äidin veren plasmassa on sekä äidin omaa että sikiön DNA:ta. Sikiön DNA on peräisin sikiön hajonneista soluista ja sen määrän perusteella voidaan tunnistaa kromosomistomutaatioita. DNA:ta sekvensoimalla voidaan puolestaan etsiä sairauksia aiheuttavia alleeleita.
134
alkiodiagnostiikka
elvitetään koeputkessa hedelmöitetyn lapsen alttiutta sairastua vaikeaan yhden geenin aiheuttamaan perinnölliseen tautiin, kun vanhemmilla on todettu tätä tautia aiheuttava geenimutaatio. Koeputkessa keinohedelmöitetyn alkion yhdestä solusta pystytään koettimen avulla tunnistamaan tämä tautialleeli, ja raskaus käynnistetään vain sellaisella alkiolla, jolla ei ole kyseistä alleelia.
135
vasta-aine
immuunijärjestelmän B-imusolun tuottama proteiini. Se tunnistaa antigeenin eli elimistölle vieraan aineen, joka on yleensä proteiini. Jokainen B-solu tuottaa ainoastaan yhdenlaista monoklonaalista vasta-ainetta, joka voi tarttua vain antigeenin tiettyyn osaan. Näin olleen yhtä antigeeniä kohtaan syntyy elimistössä useita erilaisia vasta-aineita, ja tätä seosta kutsutaan polyklonaaliseksi vasta-aineeksi.
136
miten monoklonaalista vasta-ainetta tuotetaan?
- hiiri, antigeeni, plasmasolut
- plasmasolut + syöpäsolut
- soluviljelmään, otetaan tiettyä vasta-ainetta viljelevät solut erilleen ja kasvatetaan niitä
137
miten monoklonaalisia vasta-aineita hyödynnetään antigeenitestien lisäksi?
Myös elimistön itsensä tuottamia vasta- aineita tunnistetaan verestä monoklonaalisten vasta-aineiden avulla. Virus- ja bakteeritartunnat käynnistävät elimistön puolustusjärjestelmässä vasta-aineiden tuotannon. Vasta-aineet on mahdollista tunnistaa joidenkin viikkojen jälkeen tartunnasta verestä otettavan vasta-ainetestin avulla. Esimerkiksi puutiaisen aiheuttama borrelioositartunta selvitetään tällä menetelmällä.
138
antigeenitestin periaate
- näyte liuskalle, aineet liikkuvat ylös kapillaari-ilmiö
- näyte reagenssiväriaineita sisältävän vyöhykkeen läpi, jossa fluorisoivalla leimalla varustettu monoklonaalinen vasta-aine. jos näytteessä on antigeeniä, vasta-aine tarttuu siihen
- vasta-aine-antigeenikompleksi eteenpäin. linjalla toinen monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa antigeenin ja pysäyttää kompleksin. aiheuttaa väriaineen kanssa reaktion jos näytteessä on antigeeniä
- väriaine kontrollilinjalle, jossa on esim. koronatestissä nenäontelossa normaalisti esiintyvään proteiiniin reagoivaa monoklonaalista vasta-ainetta. väriaine reagoi tämän toisen antigeeni-vasta-ainekompleksin kanssa, jos testi toimii
139
taudinaiheuttajan tunnistaminen reaaliaikainen PCR
monistetaan pieni pala taudinaiheuttajan perimästä. Taudin aiheuttajan perimän emäsjärjestys tai osa siitä tulee tuntea, jotta monistettava DNA-jakso voidaan rajata kahden alukkeen avulla. Reaaliaikaisessa PCR-menetelmässä koeputkeen lisätään alukkeiden lisäksi fluoresoivalla väriaineella varustettu koetin. Aina kun DNA-jakso monistuu koettimen kohdalla, väriaine aktivoituu ja lähettää signaalin, joka voidaan lukea PCR-ajon aikana signaalintunnistuslaitteella. Lisäksi kun käytetään eri väriaineilla värjättyjä koettimia, pystytään tutkimaan useampaa geenialuetta samanaikaisesti. Uusimmilla tekniikoilla kyetään myös määrittämään tutkittavan kohteen määrä tarkasti.
140
biomarkkerit
elimistössä esiintyviä tekijöitä tai molekyylejä, joiden määrän muutos on voitu tutkimuksen avulla yhdistää tiettyyn tautiin. Biomarkkerina voivat toimia esim. proteiinit.
141
biomarkkerien tunnistus
Biomarkkerien tunnistaminen verinäytteestä tehdään usein monoklonaalisilla vasta-aineilla. Soluviljelmässä tuotettuun vasta-aineeseen liitetään jokin merkkiaine, joka lähettää signaalin mittalaitteelle, mikäli se sitoutuu tutkittavaan proteiinin. Signaalien määrä kertoo, kuinka paljon kyseistä biomarkkeria esiintyy veressä. voidaan tunnistaa myös massaspektrometrin avulla. Massaspektrometri pystyy erottelemaan ja tunnistamaan tarkasti erilaiset molekyylit ja niiden määrät.
142
mikrobilääkkeet
Mikrobilääkkeiksi kutsutaan kaikkia niitä lääkkeitä, jotka tehoavat virusten, bakteerien, yksisoluisten loisten sekä hiiva- ja homesienten aiheuttamiin tauteihin.
143
antibiootit
bakteerien ja homeiden valmistamia aineita, joita ne käyttävät eräänlaisina biologisina aseina tappaakseen kilpailijoitaan ja estääkseen niiden kasvua ja lisääntymistä. tehoavat useimpiin bakteeri- ja sieniinfektioihin, mutta viruksiin niillä ei ole mitään vaikutusta. Antibiootit tappavat bakteereja vaikuttamalla niiden aineenvaihduntareaktioihin tai estämällä niitä lisääntymästä.
144
laajakirjoiset antibiootit
pystyvät tuhoamaan useita bakteerilajeja. etuna on, että se toimii monesti, vaikka infektioita aiheuttavaa bakteeria ei tunneta tarkasti.
145
kapeakirjoiset antibiootit
tehoavat vain yhteen tai muutamaan bakteerilajiin. etu taas on se, että se vaikuttaa vähemmän haitallisesti elimistön omaan hyödylliseen bakteerilajistoon, koska ne tuhoavat vain tiettyjä bakteereita.
146
antibioottiresistenssi
bakteerien nopean perinnöllisen muuntelun seurauksena antibiooteille vastustuskykyisiä eli resistenttejä bakteerikantoja kehittyy jatkuvasti. Antibioottiresistenssiä koodaava geeni sijaitsee useimmiten plasmidissa, jolloin resistenssigeeni siirtyy helposti bakteerista ja bakteerilajista toiseen rekombinaation tuloksena. Resistenssigeenistä on bakteerille hyötyä silloin, kun kyseistä antibioottia käytetään. Antibiootit aiheuttavat siis suuntaavaa valintaa bakteeripopulaatiossa. Jos bakteeri ei altistu kyseiselle antibiootille, resistenssigeeni voi hävitä nopeasti bakteeripopulaatiosta.
147
sairaalabakteeri
Sairaalassa syntynyttä moniresistenttiä bakteeria kutsutaan sairaalabakteeriksi.
148
fagiterapia
bakteriofagit ovat erikoistuneet käyttämään vain tiettyä bakteerilajia lisääntymisessään, joten niiden avulla pystytään tuhoamaan taudinaiheuttajabakteerit elimistöstä ilman että elimistön normaalit bakteerit tuhoutuvat. Bakteeritautien hoitoon käytettäviä bakteriofageja saadaan ottamalla näytteitä monenlaisista bakteereista ja niitä tuhoavia fageja sisältävästä jätevedestä. Erilaisia fageja testataan taudinaiheuttajabakteeriin. Kun tehokkaat fagit löytyvät, ne voidaan eristää ja käyttää niitä sairauden täsmähoitoon.
149
lääkeaineiden ja hormonien tuottaminen
Geenitekniikan avulla tuotetaan nykyisin monia sellaisia hormoneja, joita aiemmin eristettiin eläimistä tai vainajista. esim. insuliini. Näitä proteiineja tuotetaan bakteeri- ja hiivasoluviljelmissä, joihin on siirretty ihmisen kyseisen proteiinin tuottoa ohjaava geeni yhdistelmä- DNA-tekniikalla. Geeniteknisen valmistuksen etuina ovat valmisteen puhtaus ja prosessin tehokkuus.
150
interferonit
interferonit ovat elimistön omien solujen tuottamia proteiineja, jotka estävät virusten lisääntymistä. Kun virus tunkeutuu soluun, solu alkaa tuottaa paitsi viruksen rakennusosia myös interferonia. Sen vaikutuksesta virukset eivät pääse lisääntymään ympäröivissä soluissa. Näin interferoni estää tartunnan etenemisen. Interferoneja tuotetaan kolibakteereissa yhdistelmä-DNA-tekniikalla
151
monoklonaaliset vasta-aineet syövän hoidossa
Monoklonaaliset vasta-aineet ovat mahdollistaneet aikaisempaa täsmällisemmän syöpien hoidon. Solujen pinnalla on reseptoreja, joiden avulla elimistön puolustusjärjestelmä tunnistaa omat solut vieraista. Syöpäsoluille tyypilliset reseptorit toimivat antigeeneinä, joihin vasta-ainelääkkeet tarttuvat ja hidastavat solujen jakautumista. Samalla ne aktivoivat elimistön puolustusjärjestelmää hyökkäämään ja tuhoamaan syöpäsolut. Vasta-ainelääkkeitä on kehitetty edelleen liittämällä niihin solusalpaajia eli syöpäsoluja tuhoavia lääkkeitä, jotka aktivoituvat tunkeuduttuaan syöpäsoluun. Näin lääke tuhoaa ainoastaan syöpäsoluja. Näitä täsmälääkkeitä on jo käytössä rintasyövän hoidossa, ja niitä kehitetään muidenkin syöpien hoitoon.
152
mistä lääkeaineen teho riippuu?
erityisesti solukalvon kuljettajaproteiineista ja lääkeaineiden aineenvaihduntaan osallistuvista entsyymeistä. Farmakogenetiikassa selvitetään, miten kuljetusproteiineja ja lääkeaineenvaihduntaa koodaavat geenit toimivat ja minkälaisia yksilöiden välisiä eroja näiden geenien rakenteessa ilmenee.
153
perinteiset rokotteet
vaikutus perustuu heikennettyihin tai tapettuihin mikrobeihin tai niiden osiin, käytetään edelleen kaikkialla maailmassa. Nämä rokotteet ja niihin lisätyt tehosteaineet aiheuttavat kuitenkin joskus haitallisia sivuvaikutuksia, kuten kyseisen sairauden oireita. Lisäksi niiden kehittäminen ja testaaminen vaatii runsaasti aikaa ja rahaa.
154
uudenlaiset rokotteet
sisältää ainoastaan osan taudinaiheuttajan pintaproteiinista tai sitä koodaavasta nukleiinihaposta. Taudinaiheuttajan pintaproteiinit toimivat elimistössä puolustusjärjestelmän käynnistävinä antigeeneinä.
155
rokotteiden valmistus yhdistelmä-DNA-tekniikalla
taudinaiheuttajasta eristetään geeni, joka koodaa antigeeninä toimivaa taudinaiheuttajan pintaproteiinia. Eristetty geeni liitetään hiivasolun tai bakteerin plasmidiin. Siirtogeeniset hiivasolut tuottavat viruksen pintaproteiinia, joka eristetään ja käytetään rokotteessa.
156
tehosteaineet
Kun rokotuksissa käytetään yhä pienempiä osia taudinaiheuttajasta, ne eivät aina riitä aktivoimaan immuunijärjestelmää kyllin tehokkaasti. Tehokas immuunivaste edellyttää monia eri vasta-aineita, joita kaikkia ei synny, kun rokotteessa käytetään vain osia taudinaiheuttajasta. Tästä syystä rokotteisiin lisätään tehosteaineita. Tehosteaineen tarkoituksena on parantaa immuunivastetta tai estää antigeenin hajoaminen.
157
adenovirusrokotteen toimintaperiaate
1. Adenovirukseen siirretään viruksen piikkiproteiinia koodaava geeni, ja geenimuunnellut virukset ruiskutetaan sieraimeen. Jos kyseessä on RNA-virus, sen perimä muutetaan tätä ennen kaksijuosteiseksi DNA:ksi.
2. Adenovirus kuljettaa viruksen piikkiproteiinia koodaavan geenin epiteelikudoksen soluun, jossa se siirtyy tuman kromosomiin. Piikkiproteiinigeenin sisältämän informaation perusteella rakennetaan lähetti-RNA, joka toimii ohjeena solulimassa tapahtuvalle piikkiproteiinin synteesille. Valmiit piikkiproteiinit kuljetetaan epiteelisolun solukalvolle.
3. Elimistön puolustusjärjestelmä tunnistaa vieraan proteiinin ja virusvasta-aineiden tuotanto käynnistyy. Samalla elimistöön muodostuu juuri tälle virusantigeenille erikoistuneita B-muistisoluja, jotka aktivoituvat nopeasti elimistön kohdatessa uudelleen tämän saman viruksen.
158
RNA-rokotteen periaate
1. Liposomiin siirretään RNA-viruksen piikkiproteiinia koodaavan geenin ohjeen mukaan syntynyt lähetti-RNA ja ruiskutetaan liposomit lihakseen.
2. Liposomit kuljettavat lähetti-RNA:n solulimaan, jossa lähetti-RNA:n sisältämän informaation perusteella rakennetaan piikkiproteiineja. Piikkiproteiinit kuljetetaan lihassolun solukalvolle.
3. Elimistön puolustusjärjestelmä tunnistaa vieraan proteiinin ja vasta-aineiden tuotanto käynnistyy. Samalla elimistöön muodostuu juuri tälle virusantigeenille erikoistuneita B-muistisoluja, jotka aktivoituvat nopeasti elimistön kohdatessa uudelleen tämän saman viruksen.
159
geenihoito
Geenihoidoissa soluviljelmään tai potilaaseen siirretään geenivirhettä korjaavasta geenistä toimiva alleeli, jonka ohjeiden mukaan solut alkavat tuottaa puuttuvaa proteiinia. Siirrettävä alleeli liitetään sopivaan vektoriin eli kuljettimeen. Yleisimmin alleelin siirrossa käytetään virusta tai liposomia. Vektori vie geenin potilaan soluihin. Virukset ovat hyviä vektoreita, koska ne ovat evoluutionsa aikana sopeutuneet tunkeutumaan soluihin ja lisääntymään niissä.
160
geenihoito potilaan omilla soluilla
1. hoitavasta geenistä tehtyjä kopioita liitetään virus-DNA:han
2. potilaan omia soluja kasvatetaan soluviljelmässä ja ne injektoidaan viruksilla
3. hoitava geeni siirtyy osaksi solun DNA:ta
4. solut takaisin potilaaseen ja ne alkavat tuottaa puuttuvaa geenituotetta
161
geenihoito suoraan potilaaseen
1. useita kopioita hoitavaa geeniä liitetään viruksen DNA:han, liposomiin tai plasmidi-DNA:han
2. hoitavaa geeniä sisältävät vektorit potilaan hoidettavaan kudokseen
3. hoitavat geenit osaksi solun dna:ta ja solut alkavat tuottaa puuttuvaa geenituotetta
162
t-tappajasolujen käyttö syövän hoidossa
1. Potilaasta otetaan omia T-tappajasoluja
2. T-tappajasoluun siirretään juuri tietyn syöpätyypin tunnistava geeni ja T-solujen toimintaa aktivoiva geeni
3. ja 4. Geeniteknisesti muokattuja T-soluja kasvatetaan pari viikkoa.
5. Kun T-tappajasoluja on riittävästi, ne palautetaan potilaan elimistöön, jossa ne alkavat tuhota syöpäsoluja.
163
potilaan geenien muokkaus CRISPR
Korjaus on mahdollista tehdä soluviljelmän soluihin, minkä jälkeen muuntogeeniset solut siirretään potilaaseen. Tätäkin suurempia mahdollisuuksia tarjoaa sukusolujen tai niiden kantasolujen muokkaus CRISPR-menetelmällä. Tällöin jokin sairautta aiheuttava alleeli korjataan ennen koeputkihedelmöitystä, jolloin syntyvällä lapsella ei ole kyseistä alleelia.
164
geenihoidon ongelmat
Siirtogeeni kiinnittyy usein mihin kohtaan tahansa potilaan solun DNA:ta, mikä voi pahimmassa tapauksessa aktivoida jonkin syöpää aiheuttavan geenin. Myöskään virusvektorit eivät aina kykene tunnistamaan kohdesoluja riittävän tarkasti, jolloin hoito ei ole tehokasta. Vaikka geenihoidon tarkkuus on parantunut huomattavasti CRISPR-tekniikalla, ei sekään ole kaikissa kokeissa toiminut riittävän tarkasti. On olemassa riski, että Cas-entsyymi korjaa jonkun muun kuin aiotun geenin ja aiheuttaa näin ei-toivotun muutoksen perimässä. Lisäksi elimistön immunologinen puolustusjärjestelmä ei välttämättä hyväksy muunneltuja soluja, vaan alkaa tuhoamaan niitä.
165
solukorvaushoidot
korvataan potilaan tuhoutuneet tai virheelliset solut terveillä soluilla. Kudossiirtoihin liittyy kuitenkin usein hylkimisreaktioita. Niissä elimistön puolustusjärjestelmä alkaa tuhota vieraaksi tunnistamiaan soluja tai siirretty kudos alkaa hylkiä potilaan soluja.
166
solujen uudelleenohjelmointi kantasoluiksi
1. Potilaasta eristetään soluja, esimerkiksi ihon soluja, ja kasvatetaan niistä soluviljelmä.
2. Viljelmän solut ohjelmoidaan erittäin monikykyisiksi kantasoluiksi siirtämällä niihin tiettyjä alkiossa aktiivisesti toimivia geenejä virusten avulla.
3. Valitaan solut, joihin siirto on onnistunut, ja kasvatetaan niistä kantasoluviljelmä.
4. Kantasolut saadaan erilaistumaan erilaisiksi solutyypeiksi käyttämällä kasvutekijöitä ja muita kemiallisia viestiaineita.
167
kantasoluhoitojen riskit
Solujen erilaistumismekanismit tunnetaan puutteellisesti. Joidenkin tutkimusten mukaan kantasolujen käyttöön liittyy lisäksi suurentunut syöpäriski. Kantasolut saattavat jakautua hallitsemattomasti, koska ne tuottavat kromosomien telomeereja pidentävää telomeraasientsyymiä.
168
kudosteknologia
yhdistyvät biologia, lääketiede ja insinööritieteet.
169
jalostus
ihmisen tekemää eläinten ja kasvien ominaisuuksien parantamista ja valikoimista. Perinteisessä jalostuksessa hyödynnetään kasvi- ja eläinpopulaatioissa esiintyvää perinnöllistä muuntelua. Nykyisin jalostus perustuu myös DNA-tutkimukseen ja geenitekniikkaan.
170
lajike
kasveilla samaan lajiin kuuluvat, toisistaan poikkeavat yksilöt
171
rotu
eläimillä samaan lajiin kuuluvat, toisistaan poikkeavat yksilöt
172
ihmisen suosima valintatapa
suuntaava valinta, korostaa ääriominaisuuksia
173
millaiset ominaisuudet haittaavat jalostusta?
Jalostusta vaikeuttaa se, että suuri osa jalostuksen kohteena olevista ominaisuuksista on polygeenisiä eli sellaisia, joihin useat geenit vaikuttavat.
174
kasvijalostuksessa tavoitellut ominaisuudet
satoisuus ja satovarmuus, kylmänkestävyys, tuholaisten ja tautien kestävyys sekä koristekasveilla ulkonäkö.
175
eläinjalostuksessa tavoitellut ominaisuudet
eläinten terveys, nopeakasvuisuus, hedelmällisyyden ja tuotanto-ominaisuuksien parantaminen sekä lemmikkieläinten jalostuksessa ulkonäkö ja käyttäytyminen.
176
valintajalostus
ihmisen mielestä tärkeitä ja parhaita ominaisuuksia ilmentävät yksilöt valitaan jatkamaan sukua. Valintajalostus toimii samalla tavalla kuin suuntaava luonnonvalinta luonnon populaatioissa.
177
puhdas linja
Kasvijalostuksessa saadaan itsepölytteisillä kasveilla valinnan avulla aikaan puhdas linja, jossa yksilöt ovat jalostajan kannalta toivottujen geenien suhteen homotsygoottisia. Homotsygoottiset ominaisuudet säilyvät myös seuraavissa sukupolvissa. Kun valinta on johtanut puhtaaseen linjaan, jalostusta ei voida enää jatkaa valinnan avulla, koska kaikki yksilöt ovat perimältään samanlaisia halutun ominaisuuden suhteen. Kaikki muuntelu johtuu ympäristötekijöistä. papu
178
risteytysjalostus
pyritään saamaan aikaan uusia ominaisuusyhdistelmiä ja tuottamaan näin sellaisia yksilöitä, joilla on useita jalostajan kannalta hyviä ominaisuuksia. Kun valintajalostuksen tuloksena on ensin saatu aikaan jokin kasvilajike tai eläinrotu, se voidaan risteyttää toisen lajikkeen tai rodun kanssa. mansikka
179
maatiaislajikkeet ja -rodut
sellaisia viljelykasvien tai tuotantoeläinten muotoja, jotka ovat kehittyneet tietoisen ja tiedostamattoman valinnan sekä kulloinkin vallinneiden ympäristötekijöiden vaikutuksesta. Suomessa on vielä tallella maatiaisrotuja, kuten esimerkiksi suomenlammas
180
maatiaislajikkeet - ja rodut risteytysjalostuksessa
Niillä on säilynyt joitakin luonnonvalinnan suosimia ominaisuuksia, kuten tautien tai hallankestävyys, ja näin risteytysjalostuksella voidaan saada aikaan uusia, toivottuja ominaisuusyhdistelmiä. Risteytysjalostus on kuitenkin hidasta, koska maatiaisroduilla ja -lajikkeilla on myös paljon geenejä, jotka eivät ole jalostuksen kannalta toivottuja. Niinpä risteyttämistä on usein tehtävä aina uudelleen ja uudelleen.
181
heteroosi
heterotsygoottisen yksilön eli hybridin paremmuus. joissakin tapauksissa hybridi lisääntyy tehokkaammin ja on tuottavuudeltaan parempi tai kestävämpi erilaisia ympäristön stressitekijöitä vastaan. hybridimaissi
182
mutaatiot kasvinjalostuksessa
Kasvijalostuksessa on 1960-luvulta lähtien käytetty tarkoituksellisesti aikaansaatuja geeni- ja kromosomistomutaatioita. Kasviin voidaan aiheuttaa geenimutaatioita säteilyttämällä siemeniä gamma-, röntgen- tai UV-säteilyllä tai käsittelemällä niitä mutaatioita aiheuttavilla kemikaaleilla. Samankaltaisia mutaatioita syntyy luonnossakin.
183
mutaatiojalostus
seurauksena on suuri määrä satunnaisia geneettisiä muutoksia, koska mikä tahansa kasvin geeneistä voi muuttua. Käsitellyt siemenet kylvetään. Niistä kasvaneista kasveista valitaan ne, joissa ilmenee uusi hyödyllinen ominaisuus. Jalostusta jatketaan käyttämällä valintaa ja risteyttämistä.
184
polyploidisen kasvin jalostus
Kasvin kromosomisto saadaan kaksinkertaistettua käsittelemällä siemeniä tai kasvavia versoja kolkisiinilla, joka estää tumasukkulan synnyn. Tällöin kahdentuneet kromosomit erkanevat tytärkromosomeiksi, mutta jäävät samaan tytärsoluun. Tästä on seurauksena kromosomistomutaatio ja siemenistä kehittyy polyploidisia kasveja eli kasveja, joilla jokaista vastinkromosomia on enemmän kuin kaksi kappaletta. Polyploidiajalostuksen tuloksena syntyneet kasvit ovat yleensä steriilejä. Syynä on se, että solussa on liikaa samanlaisia kromosomeja eikä niitä saada eroteltua sukkularihmojen avulla eri puolille solua ja siksi meioosin 1. jakautuminen ei useinkaan onnistu.
185
polyploidiajalostus
sopii käytettäväksi kasveihin, jotka lisääntyvät suvuttomasti
186
autopolyploidia
kromosomistot ovat peräisin samalta lajilta
187
polyploidia
peruskromosomiston monistuminen
188
allopolyploidia
monistuneet peruskromosomistot ovat peräisin eri lajeilta. Tällöin risteytysten avulla saadaan tuotettua uusia lajeja. Allopolyploidian avulla jalostettuja lajeja ovat esimerkiksi ruisvehnä, mesivadelma ja retiisikaali. voidaan saada kolkisiinikäsittelyllä lisääntymiskykyiseksi. vastinkromosomeilla saadaan parit
189
haploidiajalostus
tuotetaan taimia, jotka on kasvatettu haploidisista sukusoluista eli hedelmöitymättömästä munasolusta tai siitepölyhiukkasesta. Haploidisella taimella on vain puolet kasvin normaalista kromosomimäärästä. Siksi siinä ilmenevät resessiivisetkin alleelit, koska niiden vastinalleelit puuttuvat.
190
haploidiajalostuksen vaiheet
1. Kukasta otetaan siitepölyä.
2. Siitepölyhiukkasia kasvatetaan kasvatusalustalla. Ne saadaan kehittymään alkioiksi hormonikäsittelyllä.
3. Siitepölyhiukkasista kehittyy haploidisia alkioita.
4. Alkioiden solut erilaistuvat, ja niistä kasvaa haploidisia taimia. Taimien joukosta valitaan ne, jotka ilmentävät haluttua ominaisuutta.
5. Haploidisesta taimesta saadaan kolkisiinikäsittelyllä diploidinen. Näin syntyneen diploidisen kasvin kaikki alleeliparit ovat homotsygoottisia.
191
genomivalinta
jalostuseläinten geenien tutkiminen ja tämän tiedon pohjalta tehtävä risteytettävien yksilöiden valinta
192
genomitestaus
Syntyneelle jälkeläiselle voidaan tehdä genomitestaus, jonka avulla saadaan tietoa sen perinnöllisistä ominaisuuksista, kuten kasvu- ja poikimisominaisuuksista sekä perinnöllisistä sairauksista.
Genomitestauksen avulla valitaan jalostukseen käytettäviä yksilöitä. Kun testataan monia, jopa satoja alleeleja, samanaikaisesti testistä käytetään nimitystä geenipaneeli. Geenipaneeleilla saadaan myös tietoa jälkeläisen polveutumisesta, jos sen vanhemmatkin on testattu.
193
risteytysjalostuksen haittoja
geenejä saadaan siirtymään vain sellaisten lajikkeiden, rotujen ja lähisukuisten lajien välillä, jotka risteytyvät keskenään. Jalostettavaan eliöön siirtyy toivottujen geenien lisäksi tuhansia tuntemattomia ja ei-toivottuja geenejä.
194
mutaatiojalostuksen haitat
geenien muuttuminen on sattumanvaraista ja siinä aiheutuu usein myös elinvoimaa heikentäviä geenimutaatioita.
195
risteytysjalostuksen hyvät puolet
yksittäisiä geenejä ei tarvitse tuntea. Riittää, että ominaisuus on geenien kontrolloima ja että risteytysaineistossa on ominaisuuden suhteen geneettistä muuntelua. Risteytysjalostuksella voi myös tehokkaasti jalostaa ominaisuuksia, joita ohjaa useampi geeni.
196
miksi eläinjalostuksessa geeninsiirtotekniikkaa käytetään vähemmän kuin kasveilla?
tuotantoeläimissä jalostettavia ominaisuuksia säätelee suuri määrä geenejä. erittäin kallista ja hidasta. Myöskään muuntogeenisyyden vaikutuksia eläinten hyvinvointiin, käyttäytymiseen ja rakenteeseen ei ole vielä tutkittu riittävästi.
197
tuotantoeläimien tautien poisto CRISPR
Taudin vastustuskyvyn taustalla saattaa olla vain muutaman nukleotidin muutos DNA:ssa, ja näiden nukleotidien muokkaamisella CRISPR-tekniikalla voisi olla mahdollista parantaa eläinten vastustuskykyä tartuntatauteja vastaan. Mikrobien nopean muuntautumisen vuoksi vastustuskyky ei olisi kuitenkaan pysyvä.
198
muuntogeeninen ravinto
Ruokaa, jonka raaka-aineena on käytetty muuntogeenisiä eliöitä, kutsutaan muuntogeeniseksi ravinnoksi tai useimmiten esimerkiksi tiedotusvälineissä geeniruuaksi
199
jalostuksen vaikutus geneettiseen monimuotoisuuteen
- perimältään yksipuoliset lajikkeet ja rodut
- sisäsiittoisuus
- terveysongelmat eläimillä
- Geneettisen monimuotoisuuden ylläpitämiseksi vanhojen maatiaislajikkeiden ja -rotujen säilyttäminen on tärkeää, koska niiden geenejä voidaan hyödyntää jalostuksessa, kun ympäristöolot muuttuvat esimerkiksi ilmastonmuutoksen takia.
200
etyleeni
Edistää lehtien ja kukkien karisemista sekä hedelmien kypsymistä joillakin kasveilla.
201
sytokiinit
Lisäävät ja edistävät solujen erilaistumista, edistävät itämistä sekä estävät solujen vanhenemista ja hedelmien kypsymistä
202
abskissihappo
Edistää solujen vanhenemista, estää siementen itämistä, vähentää kasvua sekä edistää lehtien ja kukkien karisemista
203
auksiinit
Lisäävät juurien muodostumista ja edistävät solujen pituuskasvua
204
gibberelliinit
Lisäävät solujen jakaantumista ja pituuskasvua sekä edistävät siementen itämistä ja silmujen kehittymistä
205
RNA-sekvensointi
voidaan tutkia kaikkien geenien tuottaman RNA:n määrää eri kudoksissa. jos muodostuu l-RNA, geeni on toiminnassa ja geenistä tehdään proteiini. kun tutkitaan geenien toimintaa, eristetään l-RNA:ta. vastin-DNA sekvensoidaan. erot solujen geenien toiminnassa voidaan selvittää tutkimalla, mistä geeneistä ja kuinka paljon l-RNA:ta on tuotettu. Tutkittavasta näytteestä eristetään l-RNA:ta. l-RNA pilkotaan paloiksi ja muutetaan käänteiskopioijaentsyymin avulla vastin-DNA:ksi. Vastin-DNA:han kiinnitetään värjätyt nukleotidit, jotka laite tunnistaa. Sekvensointilaite saa selville eksoneiden emäsjärjestyksen.
