08b Pharmaproteine Flashcards
Insulin Somatotropin Zukunftsperspektiven
Wo wird Insulin produziert und gespeichert?
- Produktion und Speicherung in der Bauchspeicheldrüße
- beta-Zellen in den Lagerhans-Inseln
Was macht Insulin?
- beteiligt an der Stoffwechsel-Regulation, besonders der Kohlenhydrate
- regt Körperzellen dazu an, Glucose aus dem Blut aufzunehmen
→ Ausgelöst durch einen hohen Blutzuckerspiegel
→ führt zur Senkung des Blutzuckerspiegels
→ wichtig für die Energieversorgung des Gewebes
Struktur von Insulin
- Polypeptidhomon aus A- und B-Kette
- Heterodimer (21+30 AS)
- A- und B-Kette über 2 Disulfidbrücken
- Disulfidbrücke in der A-Kette
Wie erfolgt die Bildung von Insulin
- wird als Präproinsulin in der Bauchspeicheldrüse synthetisiert
- Abspaltung der Signalsequenz (=Präpeptid)
- Sekretion des Proinsulins
- Bildung der Disulfidbrücken (2 zwischen A- und B-Kette, 3. in der A-Kette)
- C-Peptid wird proteolytisch herausgeschnitten
- => heterodimeres Insulin
Erkläre die 2 Typen von Diabetes
Typ 1 Diabetes
* beta-Zellen im Pankreas degenerieren
* entwickeln sich oft in jungen Jahren
* Insulin wird nicht produziert
Typ 2 Diabetes
* Insulin wird produziert, aber Rezeptoren erkennen Insulin nicht
* führt zu einer Überproduktion von Insulin
* Insulinresistenz, beta-Zellen erschöpfen
Wie unterscheiden sich menschliches Insulin von Schwein bzw. Rind
- Schwein: Unterschied in 1 AS-Position -> Isolierung aus Schweine Pankreas -> Immunreaktion
- Rind: 3 Unterschiede
Wie wurde Insulin bei EliLilly rekombinant hergestellt?
- Produktionsorganisums: E.coli
- A‑ und B‑Kette als Fusionsproteine mit β‑Galaktosidase exprimiert
- –> Bildung von Inclusion Bodies (proteolytisch stabil)
- Isolierung der Inclusion Bodies - Renatuerierung
- Entfernen des Fusionsanteils durch Bromcyanspaltung
- Renaturierung der beiden getrennten Ketten unter oxidierenden Bedingungen
Wie wurde Insulin bei Novo Nordisk rekombinant hergestellt?
- Produktionsorganismus: S. cerevisiae
- Ausscheidung eines proinsulinartigen Vorläufermoleküls mit einer verkürzten Variante des C-Peptids in den Kulturüberstand
- Entfernung des C-Peptids durch proteolytische Spaltung
- Insulin wird freigesetzt
1921 wurde erstmals Insulin aus einem Tier extrahiert. Allerdings ist man schnell zu industriellen Produktionsmethoden umgestiegen. Warum? Aus welchem Tier wurde Insulin erstmals extrahiert
- Schwein: unterscheidet sich mit 1 AS- Poistion vom menschlichen Insulin
- wurde daher als artfremd erkannt –> Immunreaktionen
- außerdem wurde der Insulinbedarf nicht gedeckt
Welches grundlegende Prinzip steckt hinter der Entwicklung von Insulin‑Analoga?
- Entwicklung humananaloger Proteine durch AS-Substitutionen (Insulinanaloga)
- verändern
- … Halbwertzeit im menschlichen Körper
- … Multimerisierungsneigung: Multimerbildung - langanhaltend wirkende Insulin; Monomerbildung - schnell wirkende Insuline
Welche beiden Modifikationen führen zu langanhaltend wirksamem Insulin?
- A‑Kette: Austausch des C‑terminalen Asparagins gegen Glycin
- B‑Kette: Anhängen von zwei Arginin‑Resten am C‑Termin us
- Änderung des isoelektrischen Punktes → Erhöhung der Präzipitationsneigung des Proteins
an der Injektionsstelle → verzögerte Wirkung ohne Änderung der Wechselwirkung mit dem
Rezeptor
Wie wird heute Insulin in E.coli produziert?
- Trägt Plasmid mit Coding-Region für Fusionsproteins + Insulin
- Fed-Batch (wichtig: gute Durchmischung und hoher Sauerstoffeintrag)
- Induzierbarer Promoter → Produktionsstart ab bestimmter Zelldichte
- Produktionsdauer ca. 24 h
- MOs inaktiviert und Zellsuspension aufkonzentriert
- Zellaufschluss durch Hochdruckhomogenisation
- Isolation der IB mittels Zentrifugation
*Mit denaturierenden Agens Fusionsprotein freigesetzt - Disulfid-Brückenbildung unter oxidativen Bedingungen
- Proteolytische Abspaltung der Präsequenz und des C-Peptids
- Reinigung
- Formulierung
Was ist ein „Miniproinsulin“ in S.cerevisiae?
- enthält…
- …Signalsequenz für Sekretion
- …enzymatische Spaltstelle
- ist der Insulin-Vorläufer
- wird korrekt gefaltet und sezerniert
Wie erfolgt die Herstellung von Insulin in S. cerevisiae
*S. cerevisiae exprimiert Miniproinsulin
* Zuerst Fed-Batch (ca. 72h) dann kontinuierlicher Betrieb (ca. 3 Wochen)
* Zuckerüberschuss/Sauerstoffmangel muss vermieden werden → Pasteur-Effekt!
- Abtrennung der Hefezellen von der Fermentationsbrühe mit
Tellerseparator - Mehrere chromatographische Schritte
- Einführen des fehlenden Threonins an Position 30 durch
Transpeptidase - Mehrere chromatographische Schritte
- Kristallisation und Lyophilisation
Warum wird bei der Insulinproduktion in Hefe zuerst Fed‑Batch und anschließend kontinuierlich kultiviert
- Fed‑Batch (~72h) für schnellen Biomasseaufbau
- Danach kontinuierlicher Betrieb (bis zu 3Wochen) für stabile, langandauernde Produktion
Was ist Somatotropin?
- (auch Somatropin genannt)
- ist ein menschliches Wachstumshormon, körpereigener Wachstumsfaktor (hGH)
- wird in den alpha-Zellen im Vorderlappen der Hypophyse produziert
- quantitativ das bedeutendste Hormon der Hypophyse
Struktur von Somatropin
- Polypeptid
- aus 4 alpha-Helices mit 2 intramolekularen Disulfidbrücken
- wird von einem einzigen Gen codiert
Funktion
- essenziell für ein normales Wachstum
- → Bei einer verminderten Produktion kommt es zu einem Kleinwuchs
- → Bei einer Überproduktion kommt es zu einem Riesenwuchs
Wofür wird Somatropin als Medikament eingesetzt?
zur Behandlung des Kleinwuchs
Wie wurde vor der rekombinanten Produktion Somatropin gewonnen? Wieso ist das heute verboten?
- Isolation aus den Hirnanahngsdrüsen Verstorbener
- Wahrscheinlichkeit der Übertragung der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und HIV-Viren
- limitierte Verfügbarkeit
Wie wurde Somatropin 1985 erstmals in E.coli produziert und welche Herausforderung ergab sich daraus?
- Bildung in Form von Inclusion Bodies
- Unterschied in der AS-Sequenz da zusätzliches Methionin am N-terminalen Proteinende
- aufwändige Reinigung
Welche Verbesserung brachte die 1994 entwickelte Sekretionsstrategie in E.coli für Somatropin?
Ein vorgeschaltetes Signalpeptid leitet das Wachstumshormon mit humanidentischer AS-Sequenz ins Periplasma aus, wo es durch osmotischen Schock freigesetzt und einfacher gereinigt werden kann.
An welche zwei Rezeptortypen kann Somatropin binden, und welche Effekte lösen sie aus?
- Rezeptor, welcher das Wachstum reguliert
- Prolactin-Rezeptor, welcher die Milchproduktion
aktiviert (Prolactin = Lactotropin)
Nenne nicht-medizinische Anwendungen von Somatropin
- rekombinantes bovines Somatotropin (rBST) wird in der Milchindustrie eingesetzt → führt nicht zum Wachstum, sondern stimuliert Milchproduktion
- Anti-Aging Mittel (keine belege für Langzeitnutzen
- Doping: Missbräuchliche Verwendung im Bodybuilding und anderen Sportarten
