08a Pharmaproteine Flashcards
Grundlagen
Was sind Pharmaproteine?
- Makromoleküle, die aus AS bestehen
- sind sehr komplex
Arten von Pharmaproteine
- Enzyme
- Botenstoffe
- Antikörper und Inhibitoren
- Vakzine
Was machen Botenstoffe? Nenne Bsp!
- Lösen durch Bindung eine intrazelluläre Reaktionskette aus
- z.B. Hormone (Insulin, Erythropoietin)
Was machen Antikörper und Inhibitoren? Bsp?
- setzen über eine Bindung die biologische Wirksamkeit der Zelle außer Kraft
- z.B. mAb zur Krebstherapie
Was sind Vakzine? Nenne Bsp!
- Oberflächenprotein, das von Pathogenen stammt
- Sequenzabschnitte, die als Antigen wirken
- z.B. Hepatitis, FSME, Covid
Warum werden Pharmaproteine rekombinant hergestellt?
durch chemische Synthese (zurzeit) nicht wirtschaftlich herstellbar
Wie können Pharmaproteine gewonnen werden?
- Isolierung aus natürlichen Quellen
- Rekombinante Produktion mithilfe von genveränderten Organismen
Vergleiche die 2 Arten der Gewinnung von Pharmaproteinen!
Isolierung aus natürlichen Quellen
* traditionell aus tierischem/humanem Gewebe, humanen Blutplasma gewonnen
* oft nur in Spuren vorhanden
* hoher Aufwand der Isolierung
* sehr kostenaufwändig
* mögliche Verunreinigungen mit Pathogenen (Hepatitis B, HIV, Creutzfeld-Jakob Krankheit)
Rekombinante Produktion mithilfe von genveränderten Organismen
* Herstellung von Pharmaproteinen mit humanidentischer AS-Sequenz
* große Mengen
* reproduzierbar
* “kostengünstige” Produktion
* erregerfrei
Welches weitverbreitete Risiko besteht bei der Herstellung von Pharmaproteinen?
allergische Reaktionen
Warum kann das ursprünglich aus Streptokokken gewonnene Enzym Streptokinase nur einmal verabreicht werden? Wozu dient das Enzym?
- Streptokinase ist ein fibrinolytisches Enzym zur Auflösung von Blutgerinnsel
- Es wird als artfremd erkannt, löst beim zweiten Mal schwerwiegende allergische Reaktionen aus
Warum können auch rekombinant hergestellte Proteine mit humanidentischer AS-Sequenz immunogen sein?
- humanidentisches AS-Sequenz bedeutet nicht immer humanidentisches Protein, da keine absolute identische posttranslationale Modifikation möglich ist. * Es wird daher als artfremd erkannt und löst unerwünschte Immunreaktionan aus
Nenne Risiken, die bei der Herstellung von Pharmaproteinen entstehen können! Was ist daher nötig?
- allergische Reaktionen
- trotz humanidentischer AS-Sequenz können die Proteine als artfremd erkannt werden und immunogen sein
- unerwünschte Nebenreaktionen durch Zellbestandteile der Produktionsorganismen
- Besondere Qualitätsanforderungen an die Produktproduktion + Aufarbeitung und
Lagerung!
Nenne vier wichtige Voraussetzungen für einen mikrobiellen Produktionsorganismus.
- Vollständig sequenziert und gut charakterisiert
- Wachstumseigenschaften in großen Volumina gut kontrollierbar
- Fähigkeit eine Vielzahl fremder Gene zu exprimieren
- Fähigkeit zur Herstellung definierter Proteine
Kriterien bei der Auswahl des Produktionsorganismus
- bevorzugt wird ein Organismus mit Sekretionsmechanismus
- soll Introns bei Expression von euk. Genen entfernen können
- spezifische Modifikationen (Glykosylierung, Faltung über Disulfidbrücken etc.)
- Produktionsorganismus ist immer ei GMO (genetically modified organism)
Was bedeutet „GRAS-Status“ bei Produktionsstämmen?
„Generally Recognized As Safe“ – gilt als sicher für die Verwendung in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie.
Verschiedene Lokalisationen der Expression in E.coli
intrazellulär
* cytoplasmatisch
* cytoplasmatisch mit Fusionsprotein
* periplasmatisch
→ Sekretion in den Kulturüberstand ist
(noch) nicht möglich
Was sind Vor- und Nachteile der cytoplasmatischen Expression in E.coli?
- Expression häufig in Form von Inclusion Bodies
- Schutz vor proteolytischen Abbau
- ~ machen bis zu 30-50% des gesamten Proteingehalts aus (hohe Aubseute?)
- Akkumulation falsch gefalteter oder aggregierter Proteine
- Produktion toxischer Proteine möglich
Wie hilft ein Fusionsprotein bei der cytoplasmatischen Expression?
- Es stabilisiert das Zielprotein
- kann nach Aufreinigung chemisch oder enzymatisch abgetrennt werden.
Welche Vorteile bietet die periplasmatische Expression in E.coli?
- begünstigt Faltung mittels Disulfidbrücken
- Freisetzung des Proteins durch osmotischen Schock
- verringerte Verunreinigung mit cytoplasmatischen Proteinen
Nenne drei Vorteile der Proteinexpression in Hefen (S. cerevisiae, P. pastoris).
- Hohe Wachstumsgeschwindigkeiten möglich
- Einfach genetisch manipulierbar
- Auxotrophie kann als Selektionsmarker genutzt werden
Welche Besonderheiten haben intrazelluläre vs. sekretierte Proteine in Hefen?
intrazellulär
* Disulfidbrückenbildung im ER
* vermehrte Hyperglykosilierung (v.a. Mannose) → Auslöser immunologischer Reaktionen; Einfluss auf Pharmakodynamik und -kinetik
Sekretion
* aktives Ausschleusen mittels Signalpeptid → wenig kontaminierende Proteine
* korrekt gefaltet
Welche Kultivierungstechnik wird meist eingesetzt?
Fed-Batch
Nachteile der kontinuierlichen Kultivierung
- keine langfristige genetische Stabilität
- keine unerlässliche Reproduzierbarkeit möglich
In welchem Organismus wird Insulin produziert? Welche Kultivierungstechnik wird eingesetzt und warum?
- in S. cerevisiae
- wird kontinuierlich kultiviert (nicht in Fed-Batch wie es üblich ist), da bei Sauerstoffmangel/Kohlenstoffüberfluss (Pasteur-Effekt) toxische Nebenprodukte produziert werden
