03a Identifizierung von MOs Flashcards
Morphologie Physiologie
1
Q
Auf welche 2 Arten kann die Morphologie untersucht werden?
A
makroskopische und mikroskopische Untersuchung
2
Q
Was wird bei der makroskopischen Untersuchung angeschaut?
A
Kolonieform und -farbe
3
Q
Was wird bei der mikroskopischen Untersuchung angeschaut?
A
- Zellform und -größe
- Zellverbände
- Beweglichkeit (Begeißelung)
- Zellwandtyp (gram-Verhalten)
- Zellförtsätze, Kapseln, Sporenbildung
4
Q
mikroskopische Untersuchung: Arten von Präparate
A
- Lebendpräparate
- Fixierte Präparate (Färbungen)
5
Q
Auflösungsgrenzen: menschliches Auge, Lichtmikroskop, STED-Mikroskop, Elektronenmikroskop
A
- menschliches Auge: 50-100 µm
- Lichtmikroskop: 1 µm
- STED-Mikroskop: 10 nm
- Elektronenmikroskop: 0,5 nm
6
Q
Unterschied: aufrecht und inverses Mikroskop
A
aufrecht:
* Betrachtung der Präparate von oben
* Mikrobiologie
* Beschränkt in der Verstellbarkeit des Objekttisches
invers:
* Betrachtung der Präparate von unten
* Zellkultur
* = “Umkehr”-Mikroskop
7
Q
Arten von Objektive und Unterschied?
A
- Trockenobjektiv: Luft füllt Raum zwischen Frontlinse und dem vorderen Element des Objektivs
- Immersionsobjektiv: Öl -> verbessert Streuung des Lichts und somit Auflösung
8
Q
Wann Lebendpräparate und wann fixierte Präparate?
A
- Je nach Fragestellung und Probe
- Lebendpräparat: “Direkt-Analyse” (z.B. Test auf Beweglichkeit, Zellform-Analyse); Nachteil: Kontrast sehr gering
- fixierte Präparate -> Färbungen: zum Nachweis spezifischer Merkmale (z.B. Gram-Färbung), Kontrastverbesserung
9
Q
Was versteht man unter Hitzefixierung?
A
Nachdem die Probe auf den Objektträger aufgetragen wurde, hält man den Objektträger über einer Flamme. So wird die Flüssigkeit entfernt, damit die Zellen beim Färben nicht weggeschwemmt werden
10
Q
Nenne Färbungen
A
- Einfache Färbung (Kontrastverstärkung) (z.B. Methylenblaufärbung)
- Kapselfärbung
- Gram-Färbung
- Nachweis säurefester Stäbchen = Ziehl-Neelsen-Färbung
- Endosporenfärbung - Sporenfärbung nach Wirtz
- Geißelfärbung - Beizfärbung
11
Q
Wozu? Wie wirkt Methylenblaufärbung?
A
- Zur Kontrastverbesserung (z.B. zur Zellform-Analyse)
- Methylenblau -> basischer Farbstoff, der in wässriger Lösung dunkelbau erscheint
- Mit Methylenblau erscheinen alle proteinhaltigen Strukturen dunkelblau
- Die Zellkerne werden stark, das Cytoplasma nur schwach angefärbt
12
Q
Was? Wozu? Wie wirkt Kapselfärbung?
A
- Nachweis von Glykocalyx
- Färbung: meist Negativ-Färbung, mit Methylenblau und Tusche -> Methylenblau passiert die Kapsel und färbt die Zelle an; Tusche ist zu groß, um die Kapsel zu durchdringen und färbt daher den Hintergrund => Kapsel bleibt ungefärbt
13
Q
Was ist die Glykocalyx? Funktion?
A
- Komplexe, dicke Schicht aus Glykoproteinen, Polysaccariden, Aminozuckern; sehr enge Matrix, die Partikel ausschließt
- Funktion der Glykocalyx: Anheftung, Biofilmbildung, Schutz vor Austrocknung, Verminderung der Wirkung von Antibiotika, wechselseitige Übertragung von Metaboliten, stabile räumliche
Assoziationen
14
Q
Erkläre die Gramfärbung
A
- zur Unterscheidung von grampositiven und gramnegativen Bakterien
- Färben mit Kristallviolett
2.Komplexierung mit Lugolscher Lösung - Entfärben mit Ethanol: grampositive bleiben violett, gramnegative werden entfärbt
- Gegenfärben mit Fuchsin/Safranin: grabnegative werden gefärbt
15
Q
Was? Wozu? Bedeutung der Ziehl-Neelsen-Färbung? Worauf beruht sie?
A
- Nachweis säurefester Bakterien (Mycobacterium tuberculosis)
- Wichtige differentialdiagnostische Hilfe zur Identifizierung bestimmter Krankheitserreger
- beruht auf der besonderen Zellwand:
- hoher Lipidanteil (Wachse, Mycolsäuren)
- Wachsartig Oberfläche (erhöht Hydrophobizität)
- Verhindert das Eindringen von hydrophilen Farbstoffen
16
Q
Durchführung der Ziehl-Neelsen-Färbung
A
- Färbung mit Karbolfuchsin (Phenolfuchsin) in der Hitze ( Hitze ermöglicht Passierend des Farbstoffs durch die Zellwand)
→ Kann trotz der Lipidhülle (Zellwand und Membran) in die Zelle eindringen
→ Der Farbstoff kann bei normaler Temperatur nur schwer wieder aus den Bakterien extrahiert werden - Behandlung mit Säure-Alkohol-Gemisch → Entfärbung der nicht säurefesten Strukturen
- Gegenfärbung mit alkalischer Methylenblaulösung: Färbung der nicht-säurefesten Bakterien
- Nur die säurefesten Bakterien behalten den Farbstoff und bleiben rot gefärbt
17
Q
Bsp. für Sporenbildner
A
Bacillus, Clostridium, Paenibacillus
18
Q
Wie werden Sporenbildner nachgewiesen?
A
- Prinzipiell lassen sich Endosporen im ungefärbten Lebendpräparat
(Phasenkontrast) als hell leuchtende Körper beobachten - ODER: Sporenfärbung nach Wirtz
- Eindeutige Identifizierung von Endosporen
- Säurebehandlung oder Erhitzen
- Farbstoff: Malachitgrün (Oxalat)
- Mit Wasser gründlich spülen
- Gegenfärbung mit Safraninlösung
19
Q
Arten von Begeißelung
A
- Monotrich: die Zelle hat nur eine einzige Flagelle
- Polytrich-monopolar: Gruppe an einem der Zellpol
- Polytrich-bipolar: zwei gegenüberliegende Gruppen
- Holotrich: zahlreiche Flagellen gleichmäßig über gesamte Zelloberfläche (peritrich)
- Polar: an einem oder beiden Polen
- Lateral: seitliche Begeißelung
20
Q
Nachweis von Begeißelung
A
- ungefärbtes Präparat -> Mikroskopie
- EM
- Geißelfärbung - Beizfärbung: die Geißeln werden mit einer alkalischen Formalinlösung gebeizt (verdickt) und mit
ammoniakalischer Silbernitratlösung gefärbt
21
Q
An welchen Aspekten im Rahmen der Physiologie kann man MOs identifizieren?
A
- Selektion von Mutationen
- Verwertung von Substraten und Analyse von Gärprodukten
- Fähigkeiten zum aeroben/anaeroben Wachstum
- Temperaturgrenzen des Wachstums, Toleranz gegenüber Säuren, Salz
22
Q
Was kann eine nicht selektierbare Mutation sein?
A
Farbverlust bei einem pigmentierten Organismus -> im Labor kein Vor- oder Nachteil
23
Q
Was ist eine Medikamentresistenz-Bestimmung? Wofür wird sie gemacht?
A
- = mikrobiologische Überprüfung der Empfindlichkeit bzw. Widerstandsfähigkeit von Bakterien gegenüber verschiedenen Antibiotika
- dabei werden die antibiotischen Grundstoffe (=Wirkstoffe) keine Fertigarzneimitteln getestet
- zur Feststellung des Hemmhofdurchmessers (HHD) oder der minimalen Hemmkonzentration (MHK)
24
Q
Tests zur Medikamentresistenz-Bestimmung
A
- Agardiffusionstest
- Agardilutionstest
- Mikrobouillondilution
- Epsilometer-Test (E-Test)
25
Wie erfolgt ein Agardiffusionstest?
* Die Agarplatte wird mit dem zu prüfenden Stamm beimpft (Ausplattieren)
* In Antibiotika getränkte **Disks** werden auf die Platte gelegt und die Platte bebrütet(inkubiert
* Messung der Hemmhofes
26
Was ist der Hemmhofdurchmesser?
* zeigt an, wie empfindlich MO gegenüber Antibiotikum ist
* bakterieller Wachstum um den in Antibiotika-getränkten Disk bei Agardiffusionstest wird gehemmt -> Durchmesser der Inhibitionszone wird gemessen
* desto größer der Durchmesser, desto empfindlicher
27
Wie erfolgt ein Epsilometer-Test?
* Variante des Agardiffusionstests
* Basiert auf einem Papierstreifen, der mit einem Antibiotikum getränkt ist, dessen
Konzentration vom Anfang des Streifens bis zu seinem Ende kontinuierlich (exponentiell)
zunimmt
* Teststreifen wird auf den Nährboden (beimpft mit der zu untersuchenden Kultur) gelegt
* Nach z.B. 24 h kann die **minimale Hemmkonzentration** abgelesen werden
28
Definition der minimalen Hemmkonzentration
= die kleinste Wirkstoffkonzentration einer antimikrobiellen Substanz, welche die
Erregervermehrung in der Kultur noch verhindert
29
Was ist das Ergebnis einer Medikamentresistenz-Bestimmung? Wie ist das Ergebnis zu lesen?
* Ergebnis = **Antibiogramm**
* **S**: sensibel gegenüber dem geprüften Antibiotikum
* **I**: sensibel bei erhöhter Exposition ("Increased)
* **R**: Resistent
30
Wie können Mutanten nachgewiesen werden?
durch Replikaplattierung
31
Wie können auxotrophe Mutanten isoliert werden
* Aufnahme und Transfer von Kolonien der Masterplatte (Vollmedium) auf eine Platte mit Vollmedium und eine mit selektiven Medium
* Inkubation und Analyse der Platten
* Vollmedium: alle Kolonien wachsen
* Selektivmedium: auxotrophe Mutanten wachsen nicht
32
Was ist die bunte Reihe? Was wird geprüft? Was ist die Voraussetzung?
* Methode zur Identifizierung von Bakterien anhand verschiedener Merkmale -> Bestimmung auf Ebene der **Gattung oder Art/Spezies** möglich (nur Bakterienstämme, keine anderen MOs)
* Prüfung von: bestimmten Enzymaktivitäten, Abbau von Substraten, Bildung von Stoffwechselprodukten, andere Fähigkeiten (z.B. aktive Bewegung)
* Voraussetzung: **Reinkultur**
33
Wie erfolgt die Durchführung der Bunten Reihe?
* Reagenzröhrchen oder Petrischalen mit verschiedenen Nährstoffen enthalten bestimmte Zusätze
* Ergebnisse werden mit einer Tabelle verglichen -> mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit kann die Spezies identifiziert werden
34
Was ist die kleine bunte Reihe? Wofür wird sie meist eingesetzt
* älteste und kompakteste Version der bunten Reihe
* enthält: Kligler-Agar, Harnstoff-Agar, MIO-Röhrchen, Simmons Citrat Agar
* v.a. zur Bestimmung von **Enterobakterien**
35
Wofür wird Kligler-Agar verwendet?
zur Identifizierung gramnegativer Darmbakterien (Salmonella, shigella, Escherichia etc.)
36
Welcher enzymatischer Prozess wird im Kligler-Agar nachgewiesen?
Abbau von Lactose durch das Enzym beta-Galactosidase (Gärung)
37
Was für ein Medium und welche Bestandteile enthält das Medium des Kligler-Agars?
* Vollmedium
* Lacotse
* Glucose
* FeSo4
* Natriumthiosulfat
* Phenolrot
38
* Kligler-Agar: Was kann zusätzlich zur Säurebildung bei bestimmten Bakterien auftreten?
* Gasbildung (CO2) und Bildung von Schwefelwasserstoff (H2S)
* typisch für einige
Arten der Gattung Citrobacter, Proteus und
Salmonella
39
Kligler-Agar: Was passiert beim Abbau von Glucose?
* Entstehung von **Säure** - pH-Indikator Phenolrot wird **gelb**
* → Entstehung alkalischer Stoffwechselprodukte aus dem Peptonabbau
* → Oxidation der Säuren an der Schrägfläche (durch Luftsauerstoff)
* → Der Nährboden wird im oberen Bereich re-alkalisiert und dieser Teil des
Mediums wird rot
40
Kligler-Agar: Was deutet eine vollständig gelbe Färbung des Mediums an?
Abbau von Glucose UND Lactose, denn es entsteht zusätzliche Säure
41
Wie ist eine Gärung ohne Sauerstoff im Kligler-Agar zu sehen?
* Bildung von CO2
* Gasblasen und Risse werden im Nährboden sichtbar
42
Wie entsteht ein schwarzer Niederschlag im Kligler-Agar? Und was zeigt er an
* aus Natriumthiosulfat wird **H2S** gebildet
* reagiert mit dem enthaltenen Eisensalz zu Eisensulfid (FeS)
* fällt als schwarzer Niederschlag aus
=> H2S Produktion und somit mögliche Anwesenheit von Proteus, Citrobacter oder Salmonella
43
Wie erfolgt die Inokulation von Kligler-Agar?
* Verwendung als **Schrägagarröhrchen**
* Inokulation: es wird senkrecht in den Agar gestochen und danach auf
der Schrägfläche in einer geschwungenen Linie ausgestrichen
44
Wozu dient der Harnstoff-Agar?
zur Unterscheidung von Urease-positiven und -negativen Bakterien
45
Was macht das Enzym Urease?
hydrolyisert Harnstoff zu CO2 und Ammoniak (NH3)
46
Urease-positive Bakterien
Klebsiella, Proteus, Yersinia
47
Urease-negative Bakterien
Escherichia, Salmonella, Shigella
48
Harnstoff-Agar: Was passiert bei Urease-positiven Bakterien im Medium
* durch das Produkt der Harnstoff-Hydrolyse NH3 -> Medium alkalisch
* pH-Indikator Phenolrot: Farbumschlag von gelb nach rotviolett
49
Harnstoff-Agar: Wie erkennt man einen positiven und negativen Urease-Test?
+: Medium rotviolett
-: gelb, kein Farbumschlag von Phenolrot
50
Wie werden Harnstoff-Agar gehalten/inkubiert?
als Schrägagarröhrchen oder in Petrischalen
51
Wozu dienen MIO-Röhrchen?
* zur Unterscheidung von Enterobakterien
Test auf
* **Motilität**
* Bildung von **Indol** aus Tryptophan durch das Enzym Tryptophanase
* Bildung von Putrescin aus Ornithin durch das Enzym **Ornithindecarboxylase** (ODC)
52
Wie erkennt man Beweglichkeit (Mobilität) in MIO-Röhrchen
* Hochschichtröhrchen (Weichagar) → durch Einstich mittels einer Impfnadel mit einer
Reinkultur beimpft
→ Begeißelte Bakterien können sich aktiv schwimmend ausbreiten, daher Trübung des Mediums auch außerhalb des Stichkanals
53
Was macht das Enzym Tryptophanase?
Abbau von Tryptophan zu Idol, Pyruvat und Ammoniak
54
MIO-Röhrchen: Wie wird Indol nachgewiesen? Wie wird ein positiver und negativer Indol-Test angezeigt
* Indol wird im Indol-Test mit **Kovacs-Reagenz** nachgewiesen
* Kirschrote Färbung: Indolbildung
* Farblos oder gelb bedeutet Indol-negativ
55
Was macht das Enzym Ornithindecarboxylase?
Abbau von Ornithrin zu Putrescin
56
MIO-Röhrchen: Was passiert beim Abbau von Ornithrin?
* Es entsteht **Putrescin**
* Das Medium wird alkalisch
* Farbumschlag von gelb nach **purpur bis violett** durch pH-Indikator **Bromkresolpurpur**
57
Wozu dient der Simmons-Citrat-Agar?
Identifizierung von Bakterien, die mit Citrat als einziger Energiequelle wachsen können
58
Welche Bakterien sind Citrat-positiv bzw. -negativ?
* positiv: Enterobacter, Klebsiella
* negativ: Escherichia und Shigella
59
Wie wird Simmons Citrat-Agar gehalten/inkubiert?
als Schrägagarröhrchen oder in Petrischalen
60
Simmons Citrat-Agar: Was passiert bei der Verwertung von Citrat in Agar?
* Citrat wird zu Acetyl-CoA und Oxalacetat umgewandelt
* Oxalacetat wird weiter zu Pyruvat und CO2 abgebaut
* Aus CO2 entsteht Wasser, Hydrogencarbonat und Ammoniak
* Alkalisierung
* pH-Indikator **Bromthymolblau** schlägt um **von grün nach blau**
61
Was zeigt ein positiver bzw. negativer Citrat-Test an?
* negativ: grün
* positiv: blau
62
Was ist SIM-Agar? Wofür dient es? Wofür steht SIM?
* Halbfestes Nährmedium
* zur Differenzierung von Enterobakterien
* Test auf: Schwefelwasserstoff-Bildung (H2S), Indol-Bildung und Motilität
63
Wie erkennt man H2S-Bildung und INodl-Bildung im SIM-Agar?
* H2S-positiv: schwarzer Niederschlag
* Indol-positiv: kirschrot
64
Wie erkennt man Beweglichkeit im SIM-Agar?
* Hichschichtröhrchen -> mit einer Impfnadel beimpft
* Trübung des Mediums über die Einstichlinie hinaus
65
Was ist der API-Test?
* = Analytical Profile Index
* Schnellbestimmungssystem zur Identifzierung von Bakterien
* miniaturisierte und standardisierte Form der bunten Reihe
66
Wie viele Reaktionsgefäße haben ein API-Streifen? Was wird mit den Reaktionsgefäßen gemacht?
Je nach System 10-50 kleine Reaktionsgefäße → diese werden mit einer Suspension der
Reinkultur inokuliert und inkubiert (meist 18 bis 24 Stunden)
67
API-Test: Wie werden Reaktionsgefäße auf dem API-Streifen behandelt, die anoxische Bedingungen brauchen
Einige Reaktionen müssen unter anoxischen Bedingungen ablaufen und werden daher **mit Paraffinöl überschichtet**
68
Wie erfolgt die Auswertung des API-Tests
* Die Resultate werden im Ergebnisprotokoll mit + bzw. – notiert, dabei sind die Reaktionen in Dreiergruppen aufgeteilt
* In jeder Dreiergruppe werden die Ergebnisse mit 1, 2 und 4 nummeriert
69
API-Test: Wie wird das numerische Profil berechnet?
* Für ein positives Ergebnis wird eine Zahl vergeben (1, 2 oder 4), für eine negative Reaktion wird eine 0 vergeben
* Die addierten Zahlenwerte jeder Dreiergruppe ergeben ein numerisches Profil
70
API-Test: Wie erfolgt die Identifizierung des Bakteriums nach dem API-Test?
* Das numerische Profil wird mit einer Datenbank verglichen
* Ergebnis: Wahrscheinlichkeit [%] der Identifizierung
