02b Anreicherung und Aufbewahrung von MOs Flashcards
Kultivierung Aufbewahrung von Reinkulturen
1
Q
Nenne Nährbodenbestandteile
A
- Wasser
- Kohlenstoff- und Energiequellen (Glucose, CO2)
- Stickstoff- und Schwefelquellen
- Mineralstoffe: Phosphat, Metallionen, Natrium
- Wachstumsfaktoren: Vitamine, AS, Purine/Pyrimidne
- Eventuell: komplexe Bestandteile
- Eventuell: Agar(-Agar)
2
Q
Was gehört zu den komplexen Bestandteilen?
A
- Extrakte biologischer Stoffe mit komplexer, variabler Zusammensetzung
- Meist sehr hoher Protein(C/N)-Anteil
- Hefeextrakt (Lieferant für B-Vitamine)
- Malzextrakt (hoher C-Anteil; zur Kultivierung von Hefen u. Schimmelpilzen)
- Pepton aus Fleisch (hoher Schwefel-Anteil; universell einsetzbar)
- Pepton aus Casein (reich an Tryptophan; für anspruchsvolle MOs)
3
Q
Was kann als Stickstoff- und was als Schwefelquelle dienen?
A
- für die meisten sind Ammoniumsalze ideal
- viele können Nitrat reduzieren und als N-Quelle nutzen (Pilze, Cyanobakterien)
- Cyanobakterien können elementaren Stickstoff N2 fixieren
- viele MOs können ihren Stickstoffbedarf auch aus organischen N-Quellen decken (/AS, Peptide, Harnstoff)
- Als Schwefelquelle dient den meisten MOs Sulfat
4
Q
Wie unterscheiden sich der Nährstoffboden von prototrophen und auxotrophen MOs
A
prototroph:
* anorganische Salze
* Kohlenstoffquelle
* Energiequelle
auxotroph:
* anorganische Salze
* Kohlenstoffquelle
* Energiequelle
* Wachstumsfaktor(en)
5
Q
Was ist Agar? Wofür wird es verwendet? Woraus besteht es?
A
- Was? Gelbildendes, komplex zusammengesetztes Naturprodukt
- Wofür? Wird am häufigsten verwendet für die Herstellung von festen Nährmedien
- Gewonnen aus marinen Rotalgen (Gelidium-Art) durch Extraktion mit heißem Wasser
- Gemisch aus mindestens 2 Polysacchariden: der gelierenden Agarose (ca. 70%) und dem nicht-gelierenden Agaropektin (ca. 30%)
6
Q
Vorteile von Agar(-Agar)
A
- Wird von den meisten MOs nicht angegriffen (außer von einigen marinen Bakterien)
- Sein Schmelz- und Erstarrungsverhalten in wässrigem Milieu machen ihn zum idealen Geliermittel für die Mikrobiologie
→ Eine 1,5%ige Lösung schmilzt bei 80-90°C und erstarrt beim Abkühlen bei 32-38°C zu einem klaren, stabilen Gel
→ Das erstarrte Gel bleibt bei Temperaturen bis 65°C und höher stabil
7
Q
Do’s and dont’s bei Herstellung von festen Nährboden
A
- Nährboden durch Umschwenken gut mischen → nicht schütteln, damit keine Luftblasen entstehen
- Deckel der Petrischale schräg etwas anheben
- In die Unterschale so viel Nährmedium gießen, dass der Boden gut bedeckt ist (15-20 mL) → das ergibt bei den Standardpetrischalen mit einem Durchmesser von ca. 90 mm eine Dicke von 2,5-3,5 cm
- Bei längerer Bebrütung oder bei höheren Temperaturen
lieber 25-30 mL pro Platte - Schalenrand nicht bekleckern und Deckel sofort wieder auflegen
- Wenn nötig: Medium durch vorsichtiges Kreisen der Petrischale auf der Arbeitsfläche
gleichmäßig über den Schalenboden verteilen - Zügig arbeiten
- Die Oberfläche muss glatt und eben sein (keine Luftblasen)
- Agarplatten mit der Unterseite nach oben stapeln (wegen Verdunstung)
- Bei längerer Lagerung: Verpackung und Lagerung mit der Unterseite nach oben im
Kühlschrank
8
Q
Inkubationsbedingungen: Einfluss auf das Wachstum von MOs haben vor allem welche Faktoren?
A
- Temperatur
- Licht
- Luftsauerstoff
9
Q
Inkubationsbedingungen: Temperatur beeinflusst welche Aspekte
A
- Wachstumsrate
- Ertrag
- Art des Stoffwechsels
- Nährstoffansprüche
- chemische Zusammensetzung der Zellen
- Synthese sekundärer Stoffwechselprodukt (z.B. Farbstoffbildung) ist häufig temperaturabhängig (niedrigeres Temperaturoptimum als für das Wachstum!)
- etc.
10
Q
Eine Erhöhung der Temperatur kann …
A
… den Bedarf an Wachstumsfaktoren herbeiführen/erhöhen
… den Polysaccharidgehalt der Zellen verringern
… den Anteil an gesättigten, unverzweigten Fettsäuren in den Membranlipiden erhöhen (-> als Schutzmechanismus gegen Hitze oder Verdunsten)
11
Q
Welche MOs bezüglich Temperatur hat man es meist in der mikrobiologischen Praxis zu tun?
A
mesophile MOs - Temperaturoptimum: 20°-40°C
12
Q
Geräte zur Inkubation/Bebrütung der MOs
A
- Brutschrank
- Schüttelinkubator
13
Q
Wo werden chemotrophe und wo phototrophe MOs inkubiert/bebrütet?
A
- chemotrophe MOs: im Dunkeln -> geschlossener Brutschrank - auf keinen Fall im direkten Sonnenlicht -> auch diffuses Licht kann wachstumshemmend wirken
- phototrophe MOs: Leuchtstoffröhrchen, Halogenlampen
14
Q
Wo werden aerobe MOs inkubiert? Was soll dabei beachtet werden?
A
- Gefäß mit einer großen Nährbodenoberfläche, dadurch wird der Gasaustausch erleichtert
- in kleinem Maßstab vorzugsweise in Petrischalen (bei Nährboden) und Erlenmeyerkolben (bei Nährlösungen)
15
Q
Wo werden anaerobe MOs inkubiert?
A
- keine Phasengrenzfläche
- gasdichter Verschluss
- z.B. hoch vollgefüllte Schraubverschlussflaschen oder -röhrchen
- oder Kulturröhrchen verschlossen mit Paraffinöl, Wattestopfen etc
16
Q
Was ist bei der anaeroben Bebrütung zu beachten?
A
- Im Allgemeinen benutzt man „fettere“ Nährböden, d.h. solche mit einem höheren Gehalt an Kohlenhydraten und komplexen Bestandteilen und bebrütet die Kulturen länger
- Gärung → starke Säurebildung → hohe Pufferkapazität der Nährböden
17
Q
Oberflächenkultur: Was enthalten feste Nährböden (Oberflächenkultur) typischerweise?
A
Sie enthalten 15–20 g/L Agar.
18
Q
Oberflächenkultur: Warum eignen sich feste Nährböden für hohe Zelldichten?
A
Je dicker die Agarschicht und je isolierter die Kolonie, desto schneller das Wachstum.
19
Q
Oberflächenkultur: Was passiert mit zunehmender Koloniegröße auf festen Nährböden?
A
Es bilden sich unter der Kolonie Sauerstoff- und Nährstoffgradienten → begrenztes Wachstum → Stillstand im mittleren Teil der Kolonie.
20
Q
Oberflächenkultur: Was wächst bei einer Kolonie auf Agar weiter, obwohl das Wachstum im Zentrum stoppt?
A
Die schmale, ringförmige Randzone der Kolonie wächst weiter, der Radius nimmt zu, die Höhe jedoch nicht.
21
Q
Oberflächenkultur: Was sind Vorteile und Nachteile fester Nährböden?
A
- Große, überall gut zugängliche Oberfläche
- Anfälliger für Kontaminationen
- trocknen schnell aus (temperaturabhängig)
→ Begrenzt die Bebrütungsdauer (Problem bei langsam wachsenden Organismen)
→ Es kann zu einer wachstumshemmenden Konzentrierung von Nährbodenbestandteilen
kommen
22
Q
Woraus bestehen Petrischalen meist?
A
Aus Kunststoff oder Glas.
23
Q
Warum werden Petrischalen mit der Unterseite nach oben inkubiert?
A
Damit kein Kondenswasser auf die Nährbodenoberfläche tropft.
24
Q
Für welche Mikroorganismen sind Petrischalen geeignet?
A
Für die Kultivierung aerober und anaerober Mikroorganismen.
25
Wie kann die Wasserverdunstung bei festen Nährböden verringert werden? (3 Maßnahmen)
* Aufstellen von offenen, mit Wasser gefüllten Schalen im Brutschrank
* Platten in einem fest verschlossenen Gefäß/Plastikbeutel inkubieren
* Inkubation in einem Brutschrank mit automatischer Regelung der relativen Feuchte
26
Wie hoch sollte die relative Luftfeuchtigkeit im Brutschrank sein?
zwischen 70-80%
27
Was ist eine Submerskultur?
* mit flüssigem Nährmedium
* in einer Nährlösung suspendierte, submers (untergetaucht) bebrütete MOs
* Kultivierung in Kolben, Flaschen, Röhrchen für Flüssigkeiten (i.d.R. aus Glas)
28
Kulturrörchen: Wofür geeignet? Wie werden Kulturen darin bebrütet?
* gut geeignet für fakultative anaerobe MOs
* Sauerstoffversorgung für strikte Aerobier unzureichend
* Verbesserung wenn die Röhrchen schräg gelegt oder sie auf einer Schüttelmaschine
bebrütet werden → **Schrägagarröhrchen** (bieten eine relativ große Agaroberfläche)
29
Kolben: Wofür geeignet? Welche Eigenschaft haben sie?
* Flüssigkeiten aerober MOs im Labormaßstab werden meist in enghalsigen Erlenmeyerkolben (100-2000 mL) angelegt
* Kolben mit **3-4 Schikanen** -> erhöhen beim Schütteln die Turbulenz der Strömung und verbessern dadurch die Durchlüftung der Kultur
30
Nachteil von Kolben
* Schlecht für strikt aerobe MOs weil sie nur gelösten Sauerstoff verwerten können -> O2 in Flüssigkeit schlecht löslich
31
Wie können aerobe MOs auch in Kolben kultiviert werden, obwohl strikte Aerobier nicht in diesen kultiviert werden
* dafür ständige, ausreichende Nachlieferung von gelöstem Sauerstoff notwendig
→ Schaffung einer großen Phasengrenzfläche zwischen Nährlösung und Luft
→ Bewegen der Flüssigkeit durch Schütteln oder Rühren, Einleiten von Luft in die Kultur
=> Dadurch auch hohe Zellkonzentrationen erreichbar
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Wie werden Zellsuspensionen in verschiedenen Kulturgefäßen gemischt?
* Kulturröhrchen -> Schüttelinkubator
* Kolben -> Schütteln - Kolben mit Schikanen
* Fermentern -> Rührblätter, Rührschaufeln
33
Was sind Fermenterkulturen?
Kultur in Bioreaktoren
34
Fermenterkultur: Vorteile und Nachteile
* gleichförmiger als viele einzelne Schüttelkulturn -> besser reproduzierbar
* anfälliger für Kontaminationen
* Intensiv gerührte und belüftete Kulturen neigen zum Schäumen
→ Kann die Sauerstoffversorgung der Kultur beeinträchtigen, den Abluftfilter durchnässen, zu Kontaminationen führen
35
Was ist bei der Fermenterkultur zu beachten
Intensiv gerührte und belüftete Kulturen neigen zum Schäumen
* Vor der Sterilisation setzt man der Nährlösung ein Antischaummittel zu
* Für Bakterien- und Hefekulturen sind Siliconöle als Entschäumer am besten geeignet
36
Woraus besteht Weichagar? Form des Nährmediums?
* enthält 1-4 g/L Agar
* halbfestes Nährmedium
37
Wofür ist Weichagar geeignet?
* Zur Prüfung der Beweglichkeit und Chemotaxis von Bakterien
* Zur Schaffung eines Sauerstoffgradienten im Nährmedium, der die Prüfung der O2-
Abhängigkeit von MOs und die Kultivierung mikroaerophiler Bakterien ermöglicht
* Für die Anaerobierkultur im Hochschichtröhrchen verwendet man oft leicht viskose Flüssignährböden, die 0,5-1 g/L Agar enthalten
38
Nenne Arten von Nährmedien
* komplex oder synthetisch: Nährstoffzusammensetzung nicht genau bekannt, ändert sich - Nährstoffzusammensetzung genau bekannt
* universal oder selektiv: Wachstum aller MOs - Wachstum eines MOs wird bevorzugt
* Minimal- oder Vollmedium
* Differentialnährboden: durch seine Zusammensetzung ermöglicht, zwei oder mehrere Mikroorganismen durch bestimmte Parameter voneinander zu unterscheiden.
39
Nenne Differentialmedien
* MacConkey Agar
* Blut Agar
* Urease Agar
40
MacConkey Agar
* Sowohl **Selektivmedium und Differentialmedium**
* Selektivmedium für gram-negative Enterobakterien → Gallensalze und Kristallviolette hemmen das Wachstum von gram-positiven Bakterien
* Differentialmedium zur Bestimmung der Laktoseverwertung mittels Laktose und pH-Indikator Neutralrot
→ laktosefermentierende Kolonien: pink, nicht laktosefermentierend: farblos (gelb)
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Blut Agar
* Differentialmedium zur Unterscheidung von α-, β-, γ-Hämolyse
* Medium mit 5-10% Blut (Schaf, Pferd, Kaninchen)
* α-Hämolyse: grüne Höfe um Kolonien; Blutfarbstoff aufgelöst und Erythrozytenmembran bleibt weitgehend erhalten
* β-Hämolyse (echte Hämolyse): scharf begrenzte Hämolysezone um Kolonien; Erythrozyten aufgelöst, Blutfarbstoff abgebaut
(Hämzone ist Indikator für Hämolyse)
* γ-Hämolyse (keine Hämolyse)
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Urease Agar
* Differentialmedium für Urease-Aktivität
* Enzym Urease setzt Urea zu CO2 und Ammonium um
* Unmittelbare Umgebung eines Urease-positiven MOs wird in Gegenwart von Urea basisch
* Enthält pH-Indikator (z.B. Phenolrot), positiv: pink; negativ: gelb
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Was ist zu beachten bei der Wahl der Aufbewahrungsmethode?
* Zellen müssen vermehrungsfähig bleiben
* Eigenschaften des Stammes dürfen sich nicht verändern
* Keine Kontaminationen
* Kosten und Arbeitsaufwand
* Anzahl der aufzubewahrenden Kulturen
* Platzbedarf für die Lagerung und Möglichkeiten des Transports
* Benutzungshäufigkeit der Kulturen
44
Methoden zur kurz- und mittelfristigen Aufbewahrung
* Periodisches Überimpfen
* Trocknen
45
Aufbewahrung: Periodisches Überimpfen - was ist es, wie funktioniert es, geeignet für?
* Periodisches Überimpfen der Kulturen auf frischen Nährboden
* Traditionelle Methode
* Geeignet zur Anlage von Arbeits- und Gebrauchskulturen für den täglichen Bedarf
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Aufbewahrung: Periodisches Überimpfen - Nachteile
* Spontane Mutationen
* Hohe Kontaminationsgefahr
* Schwierig bei empfindlichen Organismen
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Durchschnittliche Überlebensdauer von vegetativen Bakterien, Endosporen und Pilze bei der Aufbewahrung
* Vegetative Bakterien: wenige Tage bis 6 Monate
* Endosporen: 1-10 Jahre
* Pilze: ½ bis 2 Jahre
48
Aufbewahrung: Trocknen - geeignet für?, Vorteil, Nachteil
* Geeignet für heterotrophe (nicht hitzeempfindliche) Bakterien und sporenbildende Pilze
* Können mehrere Jahre im getrockneten Zustand überleben
* Geringer Aufwand + gleichbleibendes Inokulum
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Methoden zur langfristigen Aufbewahrung
* Gefriertrocknung
* Tiefgefrieren (-80° bei häufigem Gebrauch, flüssiges Stickstoff bei seltenerem Gebrauch)
50
Was ist zu beachten bei der langfristigen Aufbewahrung von MOs?
* Vorhandensein einer Reinkultur
* Kultivierung unter optimalen Bedingungen (why? Frieren ist Stressfaktor, daher darauf achten, dass es den MOs davor gut geht)
* Hinzugabe von Schutzstoffen
* Kurze Zeitspanne zwischen Herstellung der Zellsuspension und der Konservierung
* Konservierung von kleinen Volumina (0,1-1 mL)
* Vermeidung einer rauen Behandlung der Zellen
* Vermehrungsfähigkeit, Reinheit und Konstanz der charakteristischen Eigenschaften regelmäßig überprüfen!
51
Vorteile des Tiefgefrierens
* Die beste Methode für fast alle MOs
* Hohe genetische Stabilität der Zellen
* Gute Konstanz der Zellmerkmale über lange Zeiträume
52
Nachteile des Tiefgefrierens
* Hohe Kosten
* Oft geringe Lagerkapazität
* Ausfall der Kühlung (?)
* Gesundheitliche Risiken beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff
* Verwendung von geeigneten Kryogefäßen notwendig
* Probleme der Zellschädigung
→ Bildung von Eiskristallen
→ Zunahme der intrazellulären Konzentration an gelösten Stoffen
* Zusatz von Schutzstoffen
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Tiefgefrieren: Wie viel und welche Schutzstoffe werden zugesetzt und warum?
* 10% Glycerin - Bakterien, Hefen, Pilzhyphen und Pilzsporen
* 5-10% DMSO - Algen
* Dringen leicht in die Zelle ein
* Stabilisieren die Hydrathülle der Proteine
* Verhindern eine Denaturierung der Proteine
* Verlangsame das Wachstum der Eiskristalle
