05a Bioverfahrenstechnik Flashcards
Biotechnologische Produktionsverfahren Upstream Processing Fermentation
1
Q
In welchen Bereichen wird Biotechnologie eingesetzt?
A
- Landwirtschaft
- Umwelt
- Medizin/Pharmazie
- Lebensmittel
- Industrie
- Marine Biotechnologie
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Q
Ziele der mikrobiellen Biotechnologie
A
- Gezielte Herstellung von Stoffwechselprodukten
- Gewinnung rekombinanter Peptide/Proteine
mit MOs - Nutzung von Leistungen biologischer Systeme
- Gewinnung von Bio- oder Zellmasse
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Q
Wozu dient die mikrobielle Biomasse als Zielprodukt der Biotechnologie
A
- Als Futtermittel und Nahrungsstoff
- Pharmazeutisch wichtige MOs (z.B. Lactobacillen)
- Landwirtschaftliche Produkte ( Pflanzendüngemittel und Pestizide)
- Bakterielle Entfernung von Mineralölen
4
Q
Nenne Mikrobielle Produkte, die Zieldprodukte der Biotechnologie sind
A
- Lebensmittel
- Technische Alkohole und Ketone
- Organische Säuren
- Fette, Vitamine, Aminosäuren
- Pharmazeutische Produkte (Pharmaproteine)
- Antibiotika
- Rekombinante Enzyme
- Steroide und Aromastoffe
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Q
Vorteile biotechnologischer Produktionsverfahren gegenüber chemischer Produktionsverfahren
A
- Laufen unter weniger extremen Bedingungen ab
→ Keine giftigen Chemikalien, niedrige Temperaturen, niedriger Druck
→ Teilweise ökonomische und ökologische Vorteile gegenüber chemischen Prozessen - Manchen Verbindungen können nur biotechnologisch und nicht chemisch hergestellt werden (v.a. Pharmaproteine)
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Q
Nachteile biotechnologischer Produktionsverfahren gegenüber chemischer Produktionsverfahren
A
- niedrige Temperaturen => Limitierung der Reaktionsgeschwindigkeit
- Oft größere Anlagen notwendig, um dennoch eine gute Produktivität erreichen zu können
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Q
Erkläre den Ablauf eines biotechnologischen Produktionsverfahrens
A
Upstream Processing: Kultur “erstellen”
* Vorbereitung und Sterilisation der Kulturgefäße
* Ansetzen und Sterilisieren der Nährmedien
* Beimpfen und Anzüchten der Vorkultur
Fermentation: Produktion
* Kultuvierung und Produktbildung in Bioreaktioren unter kontrollierten Bedingungen
* Prozesssteuerung
* On-line Erfassung und Kontrolle der wichtigsten Kulturparameter
Downstream Processing: Aufreinigung
* Abbruch der Kultivierung
* Zellabtrennung und ev. Zellaufschluss
* Isolierung und Aufreinigung des gewünschten Produkts
* Aufarbeitung und Entsorgung der Reststoffe und Abfälle
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Q
Wie wird die Bioverfahrenstechnik noch genannt?
A
= Bioprozesstechnik, Bioengineering
9
Q
Definition bzw. Rolle der Bioverfahrenstechnik? Welche Aspekte gehören dazu?
A
Beschäftigt sich mit der verfahrenstechnischen Umsetzung eines Bioprozesses → ermöglicht
die technische Nutzung von Stoffumwandlungen durch biologische Prozesse (Zellen, Enzyme)
- Planung und Umsetzung eines Verfahrens
- Entwicklung der Prozesskontrolle und Aufarbeitungsmethoden
- Steuerung von Produktionsprozessen
- Laufende Optimierung
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Q
Was gehört zum Upstream Processing?
A
- Zellanzucht
- Medienherstellung
- Vorversuche
- Der Umstieg von Small-scale zu Large-scale
- Optimierungsprozesse (ermöglicht Small-scale zu Large-Scale)
- Planung und Vorbereitung
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Q
Was versteht man unter effizientes und kostengünstiges Produktionsverfahren?
A
- (keine) Nebenprodukte – oder rezyklier-bar
- Oft komplexe Produktionsprozesse mit niedrigen Produktkonzentrationen (?)
- Minimale Anzahl an Aufarbeitungsschritten (Down Stream Processing!)
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Q
Ziel des USP für einen optimierten Prozess?
A
Wahl des geeigneten biologischen Systems zur Herstellung des Bioproduktes
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Q
USP: Welcher Organismus ist optimal für die Produktion des Wunschproteins? Nenne Organismen, die oft eingesetzt werden
A
Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis
14
Q
Nenne Vorteile und Nachteile von E.coli für die Bioverfahrenstechnik
A
E.coli
* + Am häufigsten eingesetzt für die Produktion pharmazeutisch genutzter Proteine → langjährige Erfahrung
* + Sicherheitsstämme - nicht mehr pathogen ( = Stämme, die genetisch so manipuliert sind, dass sie uns nicht mehr infizieren
können)
* + Vielzahl von Stämmen und Plasmiden stehen zur Verfügung
* + Schnelles Wachstum, preisgünstiges und voll-synthetisches Medium, hohe Produktionsraten
- LPS-Komplexe; Inclusion Bodies; keine posttranslationalen Modifikationen
- Periplasma hält Proteine zurück
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Q
Nenne Vorteile und Nachteile von S. cerevisiae für die Bioverfahrenstechnik
A
- Am besten untersuchter, eukaryotischer MO
- Viel industriell eingesetzt → viel Erfahrung
- Schnelle Wachstumsrate
- Hohe Zellausbeute
- Sekretion ins Medium möglich
- Starke konstitutive und induzierbare Expressionssysteme vorhanden
- kann mRNA und Proteine prozessieren
- Keine Antibiotikaselektion → Plasmide werden über die Komplementation von
Aminosäure- und Nukleotidauxotrophien in den Organismen stabilisiert
- Keine Antibiotikaselektion → Plasmide werden über die Komplementation von
- Plasmide nicht stabil
- Repliziert die meisten bakteriellen Plasmide nicht
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Q
Nenne molekulare Methoden, um MOs genetisch zu ändern
A
- molekulares Klonieren
- Genetic engineering
- Transformation
- Transduktion
- Konjugation
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Q
Ziel der Fermentation für einen optimierten Prozess? Welche Fragen sollte man sich stellen?
A
Wahl des geeigneten Verfahrens und der Betriebsbedingungen
- Welche Betriebsweise eignet sich am besten?
- Welcher Reaktortyp ist passend?
- Welche Prozessbedingungen müssen aufrechterhalten werden? Welche Mess- und Regelungstechnik ist erforderlich?
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Q
Arten der Prozessführung/Betriebsweise
A
- Diskontinuierliche Prozessführung: Batch, Fed-Batch
- Kontinuierliche Prozessführung (steady-state): Chemostat, Turbidostat, Perfusion mit Zellrückhaltung
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Q
Was zeichnet ein Batchprozess aus?
A
- = Chargenprozess
- Wachstum ohne zusätzliche Zugabe von Substrat, aber Zugabe von Luft/Sauerstoff [aerobe MOs], Säuren oder Basen [pH-Regelung], Antischaummittel [Unterdrückung der Schaumbildung] => Batch-Reaktior ≠ geschlossenes System
- Substrat wird in Biomasse und Produkt umgesetzt
- sind einfach und zuverlässig → weit verbreitet in der industriellen Praxis
- begrenzt durch das Fassungsvermögen des Reaktors und durch die Substratkonzentration
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Q
Wann wird ein Batch Prozess gestoppt?
A
- wenn das Zellwachstum zum Erliegen kommt
→ Substrat verbraucht
→ Akkumulation inhibierender Metaboliten - wenn die maximale Produktkonzentration erreicht ist
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Q
Was zeichnet ein Fed-Batch Prozess aus?
A
- Überwindung der Wachstumslimitierung eines Batch-Prozesses
- Prozess wird als Batch gestartet (Semi-Batch) – Bioreaktor nur zu ca. 1/3 gefüllt
- Substratkonzentration erreicht limitierende Werte → frisches Medium (Feed) wird zugefüttert (Zulauf-Verfahren)
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Q
Verschiedene Strategien der Zufütterung beim Fed-Batch Prozess
A
- Bei vorgegebener (konstanter) Wachstumsrate
- Bei konstanter Substratkonzentration
- Bei Substratlimitierung
- Kontrolliert durch den Sauerstoffverbrauch
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Q
Vorteile und Nachteile des Fed-Batch Prozesses
A
- Verlängerte Wachstumsphase → höhere Produktkonzentration/-ausbeute
- Keine Substratinhibierung der Wachstumsrate
- Geringere Sekretion von toxischen Sekundärmetaboliten
- Begrenzung der Reaktionsgeschwindigkeit → Vorteil bei stark exothermen Reaktionen
- Bessere Reproduzierbarkeit
- Höherer apparativer Aufwand
→ Zusätzlicher Vorlagetank für Feed
→ Größerer regelungstechnischer Aufwand für die Steuerung
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Q
Wofür steht CSTR?
A
Continous stirred tank reactor
(Chemostat)
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Vorteile und Nachteile des Chemostats
* Eignet sich gut zur Bestimmung kritischer Parameter
→ z.B. Wachstumskinetik
→ Gezieltes Einstellen einer bestimmten Wachstumsrate möglich
→ Daten, gewonnen aus stationären Zuständen, verlässlicher
* Bedingt geeignet für industrielle Prozesse
→ Geringe, maximale Biomassekonzentration (ähnlich wie Batch)
→ Nicht geeignet für die Produktion von Sekundärmetaboliten (weil diese in der stationären Phase produziert werden, aber die MOs im Chemostat befinden sich in der exponentiellen Phase)
→ Hoher Installationsaufwand
→ Hohe Anforderungen an die Steriltechnik
→ Überwiegend in der Umwelttechnik (aerobe Abwasserreinigung)
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Was zeichnet ein Chemostat aus?
* Es wird kontinuierlich frisches Medium zugepumpt und verbrauchtes Medium (+ Biomasse) abgepumpt
* **Offenes System**
* Prozess startet als Batch-Kultur
* Substratkonzentration (S) sinkt auf kritische Werte ab → Start des Mediumzulaufes mit einer konstanten Pumprate
* Volumen des Reaktors bleibt konstant → gleicher Volumensstrom wird abgesaugt
* befindet sich in einem **stationären Zustand** - konstante Prozessparameter, d.h.
→ Substrat – dS/dt = 0
→ Biomasse/Zellkonzentration – dX/dt = 0
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Wann wird mein Produkt vom MO gebildet?
* Produktbildung in Abhängigkeit von Wachstum und Substratverbrauch
* Primärmetaboliten -> Bildung während der Wachstumsphase (exponentielle Phase)
* Sekundärmetabolien -> Bildung in der stationären Phase oder bei starker Substratlimitierung
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Gaden formulierte 3 grundsätzliche Fermentationstypen: diese sind? was kennzeichnet sie aus?
TYP I
* Produkt leitet sich direkt aus dem Primärstoffwechsel zur Energiegewinnung ab
* Substratverbrauchsrate, Wachstumsrate und Produktbildungsrate verlaufen parallel
* Direkter Zusammenhang zwischen Substratverbrauch und Produktbildung
* Ethanol, Milchsäure
TYP II
* Produkt leitet sich aus dem Primärstoffwechsel ab, die biochemische Bildung erfolgt jedoch über Seiten- bzw. Nebenwege
* in verschiedenen Zeitphasen des Prozesses sind unterschiedliche Maxima für Substratverbrauchsrate zu beobachten
* Aceton, Butanol, Citrat
TYP III
* Wachstum und Primärstoffwechsel sind zeitlich eindeutig von der Produktbildung entkoppelt
* Es entsteht indirekt aus dem Energiestoffwechsel
* Die Zusammensetzung des Produktes ist komplex
* Penicillin
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Welche Reaktorvolumina sind erforderlich für (1) rekombinante Proteine, (2) industrielle Enzyme, (3) Antibiotika, (4) Bäckerhefen
1. 0,5-50 m3
2. 80-250 m3
3. 80-200 m3
4. 100-250 m3
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Nenne einen Bioreaktor
Rührkessel-Bioreaktoren
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Beschreibe Rührkessel-Bioreaktoren
* Werden überwiegend eingesetzt
* Zylindrisches Gefäß mit ein oder mehreren Rührern auf einer Welle (motorbetrieben)
* Begaser in Bodennähe
* Strombrecher – unterdrücken Wirbelbildung
* Temperierung über Doppelmantel
* Zu 70-80% gefüllt
* Eventuell mechanische Schaumzerstörer
* Reaktoren aus Glas
→ Bis zu 15 L
→ Transparent, gut zu reinigen und dampfsterilisierbar
→ Rührer etc. aus Stahl
* Reaktoren aus Stahl als Alternative
* H/D = 1-2 ist üblich
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Was ist die Herausforderung in Rührkessel-Reaktoren? Arten von Rührern (in Rührkessel-Reaktoren? Wann wird welche eingesetzt?
* Herausforderung: Gewährleistung einer ausreichenden Durchmischung und Begasung!
* Scheibenrührer - gute Durchmischung
* Propellerrührer bei scherempfindlichen MOs + hoher Sauerstoffeintrag
* Ankerrührer – großflächig; bei viskösen Flüssigkeiten
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Arten von Prozessgrößen? Nenne Prozessgrößen? Welche sind online bzw. offline?
**Chemische Prozessgrößen** - Online
* pH-Wert
* O2
* CO2
* **Physikalische Prozessgrößen** - Online
* Druck
* Schaumbildung
* Temperatur
* Füllstand
* **Biologische Prozessgrößen** - Offline
* Biomassekonznetration
* Enzymkonzentration
* Biomassezusammensetzung
* Anteil lebender Zellen
* Morphologie
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Womit werden chemische Prozessgrößen gemessen? Was ist die Regelungstechnik?
* pH-Wert: pH-Gaselektrode/-Meter -> externes Einbringen von Säure/Base
* O2: Sauerstoffelektrode -> Erhöhung der Zuluft, Verwirbelnd der zugeführten Luft
* CO2: CO2-Elektrode -> Abführung von CO2
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Womit werden physikalische Prozessgrößen gemessen? Was ist die Regelungstechnik?
* Druck: Membransensoren - Abführen von Überdruck (Ventile)
* Schaumbildung: Widerstandsmessung -> Antischaummittel (Pumpe, Schlauch)
* Temperatur: Thermometer -> Wärme oder gekühltes Wasser hinzugeben (Doppelmantel)
* Füllstand: Pegelsonde/Füllstandmesser -> Zuführung des Feeds (Pumpen, Waagen)
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Messung biologischer Prozessgrößen bzw. offline Regelungstechniken
* Bestimmung der **Zellzahl [Zellzahl/mL]** (Gesamtzellzahl und/oder Lebendzellzahl) und/oder der **Biomasse [g/L]**
* Es muss eine repräsentative Stichprobe genommen werden
→ Homogene Zellsuspension
→ Mehrere Proben (3-10)
→ Probenahme unter sterilen Bedingungen
→ Probe so schnell wie möglich verarbeiten
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Wie wird die Gesamtzellzahl und die Lebendzellzahl bestimmt?
* Gesamtzellzahl: Direkte mikroskopische Zählung der Zellen - schnell und einfach, aber keine Differenzierung
* Lebendzellzahl: Bestimmung der Anzahl der Zellen, die in der Lage sind auf einem geeigneten Agar-Medium
Kolonien zu bilden -> d.h Probe zuerst ausplattieren (Oberflächenplattierungsverfahren oder Gussplattenverfahren)
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Wozu bestimmt ma die Biomasse (Konzentration und Zusammenstzung)?
* zum Verfolgen des Wachstumsverlauf
* zur Bestimmung von Zellerträgen
* als Bezugsgröße für Stoffwechsel- und Enzymaktivitäten
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Nenne Methoden zur Bestimmung der Biomasse! Nachteil der Methoden?
* Nachteil: keine Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen
* Direkte Methoden: unmittelbare Erfassung der gesamten Biomasse / eines repräsentativen Zellbestandteils - Bestimmung der Feuchtmasse, Bestimmung der Trockenmasse, Proteinbestimmung
* Indirekte Methoden: Bestimmung eines von den MOs hervorgerufenen Effekts, welcher zur Zellmasse in Beziehung steht (einfacher und empfindlicher als direkte Methoden)
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Bestimmung der Biomasse: Methode - Bestimmung der Feuchtmasse
* direkte Methode
* Gravimetrische Bestimmung nach Zentrifugation/Filtration der Zellsuspension
* Schnelle aber sehr unzuverlässige Ergebnisse
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Bestimmung der Biomasse: Methode - Bestimmung der Trockenmasse - Beschreibe und nenne die Nachteile
* direkte Methode
* Eindeutigste und am häufigsten bestimmte Größe
* macht 10-20% der Feuchtmasse aus
* Zur Bestimmung von Zellerträgen und Ertragskoeffizienten
* Bezugsgröße bei der Analyse einzelner Zellbestandteile
* dient zur Eichung anderer, indirekter Bestimmungsmethoden
* Methode der Wahl für fädige MOs (Pilze) oder MOs die in Zellverbänden wachsen
* - Sehr zeitaufwändig und langsam
* - Geringe Empfindlichkeit
* - Fehleranfällig
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Bestimmung der Biomasse: Methode - Proteinbesimmung
* direkte Methode
* Einzelne, chemische Zellbestandteile zur direkten Bestimmung der Biomasse
* Müssen einen genügend großen Teil der Zellmasse ausmachen
* Gleichbleibendes Verhältnis zur Gesamtbiomasse
* Gesamtstickstoff, Referenzproteine
* Zellproteingehalt wird routinemäßig verwendet v.a. als Bezugsgröße für Stoffwechsel- und
Enzymaktivitäten
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Nenne indirekte Methoden zur Bestimmung der Biomasse
* Trübungsmessung
* Sauerstoffaufnahme
* Kohlendioxidabgabe
* Säurebildung
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