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Angewandte Mikrobiologie > 05b Bioverfahrenstechnik > Flashcards

05b Bioverfahrenstechnik Flashcards

Downstream Processing

1
Q

Ziele des DSP

A
  • Wahl geeigneter Aufarbeitungsverfahren für das gewünschte Produkt
  • Minimierung und Verwertung der Rückstände
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2
Q

Zentrale Fragen des DSP

A
  • Wo befindet sich das Produkt?
  • Welche Aufarbeitungs- und
    Reinigungsschritte sind notwendig?
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3
Q

Wo kann das Produkt sich befinden? Welcher Ort wird bevorzugt?

A
  • extra- oder intrazellulär
  • extrazellulär: Ziel ist prinzipiell eine Überproduktion und Ausscheidung -> “leichtere” Aufarbeitung
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4
Q

Nenne Produkte die extrazellulär vorliegen

A

werden ausgeschieden zur Entgiftung:
* Ethanol
* Milchsäure
* Essigsäure
* Butanol
* Aceton

Enzyme für die extrazelluläre Verdauung
* Amylasen
* Cellulasen
* Proteasen

Zur Vermeidung zellulären Stress
* Biopolymere
* Exopolysaccharide
* Antibiotika

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5
Q

Wie kann eine Überproduktion und Ausscheidung der Produkte für eine “leichtere” Aufarbeitung erreicht werden?

A

Kann erreicht werden durch …
… die Auswahl spezieller Produktionsstämme
… die Wahl geeigneter Kulturbedinungen
… das Setzen gezielter Maßnahmen zur Beeinflussung der Zellpermeabilität
… die Verwendung genetisch gezielt veränderter Produktionsstämme

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6
Q

Welche Aufarbeitung- und Reinigungsschritte sind notwendig für intra- und extrazelluläre Produkte

A

intrazellulär
* Zellaufschluss (mechanisch, physiko-chemisch, biologisch)
* Zellabtrennung
* Produktreinigung (+ Inaktivierung von Kontaminanten)
* Formulierung, Qualitätskontrolle, Zulassung

extrazellulär
* Zellabtrennung (Sedimentation, Zentrifugation, Filtration)
* Produktreinigung (+ Inaktivierung von Kontaminanten)
* Formulierung, Qualitätskontrolle, Zulassung

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7
Q

Funktion und Ziel des Zellaufschluss

A
  • bei intrazellulären Produkten
  • Zellwände und Zellmembran werden zerstört -> Ausschüttung des Produktes in das Medium
  • Wichtig: Aktivitätsverlust des Produkts gering halten
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8
Q

Mechanische Verfahren des Zellaufschluss in der Industrie

A
  • nutzt Druck und Vermahlen

Kugelmühle
* Rotierender Hohlzylinder
* Mit Glas- oder Metallperlen als Mahlkörper (0,1-1 mm)
* Mechanischer Stress wird auf die Zellen ausgeübt
* Zellen werden stark belastet und brechen auf

  • Optimaler Füllstand: 80-85%
  • Optimale Mahlguttemperatur: 5°C
  • Suspensionskonzentration hat einen geringen Einfluss auf den „Aufschlusserfolg“
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9
Q

Mechanische Verfahren des Zellaufschluss im Labor

A
  • Vermahlen, Rühren, Druck, Ultraschall

Geräte:
* Mörser und flüssiger Stickstoff
* Standmixer
* Vortex
* Ultraschall: Durch Ultraschall stoßen die Zellen ständig aneinander und brechen auf → Wärmeentwicklung kann ein Problem sein bei großen Volumina

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10
Q

Physikochemische Verfahren des Zellaufschluss in der Industrie

A
  • Osmotischer Schock
  • Lyse der Zellen durch eine starke Senkung der Tonizität (effektive Osmolarität)
  • Hypotone Lyse
  • Gefriertrocknung
  • Detergenzien
  • Lösungsmittel
  • Säuren/Basen
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11
Q

Physikochemische Verfahren des Zellaufschluss im Labor

A
  • Einfrieren/Auftauen
  • Freeze-Thaw Method (Warm-Kalt-Warm-Kalt)
  • Zellen werden durch Scherkräfte der entstehenden Eiskristalle und Perforation zerstört
  • Detergenzien
  • Lösungsmittel
  • Säuren/Basen
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12
Q

Vorteile und Nachteile von Zugabe von Detergenzien, Lösungsmittel, Säuren/Basen für den Zellaufschluss

A
  • Bei Zellen, die sich nicht leicht aufbrechen lassen (z.B. Hefen)
  • meist schonender als mechanische Verfahren
  • ABER: Zusatzstoffe müssen wieder abgetrennt werden -> aufwendige Reinigung
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13
Q

Nenne Detergenzien für den Zellaufschluss

A
  • Trizol
  • Toluol
  • Triton-X-100
  • alkalische Lyse
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14
Q

Funktion der Behandlung mit Trizol

A
  • zum Zellaufschluss
  • Variante der Phenol-Chloroform Extraktion
  • Aufschluss durch Herauslösen der Membranlipide
  • Je nach Protokoll eventuell denaturierend
  • In Kombination mit mechanischem Aufschluss
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15
Q

Biologische Verfahren des Zellaufschluss in der Industrie

A
  • Lytische Enzyme
  • Antibiotika
  • Phagen
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16
Q

Biologische Verfahren des Zellaufschluss im Labor

A

Lytische Enzyme

17
Q

Vorteile und Nachteile der lytischen Enzyme

A
    • für Produkte, die empfindlich gegenüber thermischer oder mechanischer Behandlung sind
    • nicht sehr effizient
    • teuer
    • oft eine Kombination mit mechanischem Aufschluss
18
Q

Lytisches Enzym für Hefezellen

A

Zymolyase - zerstört die Glucan-Zellwand

19
Q

Wie werden grampositive bzw. gramnegative Bakterien lysiert?

A
  • Bei gram-positiven Bakterien wird die Peptidoglycanhülle durch die Behandlung mit
    Lysozym zerstört; Lösen der Zellmembran mit Triton-X-100
  • Bei gram-negativen Bakterien wird durch die Behandlung mit EDTA das LPS der äußeren Zellmembran gelöst; danach Behandlung mit Lysozym und Triton-X-100
20
Q

Zellabtrennung: Was wird allgemein gemacht?

A

Um Zellen und Zelltrümmer vom produkthaltigen Medium zu trennen

21
Q

Methoden zur ZellabtrennnugÜ

A
  • Sedimentaton
  • Zentrifugation
  • Filtration
22
Q

Wie funktioniert Sedimentation?

A
  • basiert auf Dichteunterschied zwischen fester und flüssiger Phase
  • Zellen und Zelltrümmer haben die Eigenschaft zu aggregieren -> kann durch die Zugabe von Flockulationsmitteln beschleunigt werden
  • Aggregate sinken durch die Gravitation zum Boden
  • 1-10 mm in 24h bei MOs
23
Q

Einsatzbereiche der Sedimentation

A

Klärwerktechnik, Brauereiprozesse

24
Q

Vorteile und Nachteile der Sedimentation

A
    • kostengünstig
    • dauert sehr lange
    • Überstand ist meist nicht komplett zellfrei, sondern nur zeltarm
25
Funktion der Zentrifugation
* basiert auf Dichteunterschied zwischen fester und flüssiger Phase * Ähnlich wie die Sedimentation (**Gravitationskraft**) → hier wird aber die Absetzgeschwindigkeit durch die **Zentrifugalkraft** erhöht
26
Zentrifugieren kann man auf 2 verschiedene Arten. Was kennzeichnet sie aus? Vorteile und Nachteile
Diskontinuierlich * muss immer wieder gestoppt und entleert werden * + Konstruktion einfacher * - Betriebsweise aufwendiger und teuer Kontinuierlich * Zentrifugat und Sediment können kontinuierlich voneinander getrennt werden * - Konstruktion komplexer * + Betriebsweise günstiger
27
Was ist eine Teilerzentrifuge?
* Feststoffe und ein/zwei Flüssigkeitsphasen werden kontinuierlich voneinander getrennt -> guter Trenneffekt * am häufigsten eingesetzt * 4-60 L Fassungsvermögen und 10.000-85.000 L/h Durchlaufende
28
Vorteile und Nachteile der Teilerzentrifuge?
* + universell einsetzbar * + Selbstreinigung der Teller * - Teuer
29
Funktion Filtration
* Abtrennung mittels **poröser Membranen** * Dickeunterschied zwischen Trenngut und flüssiger Phase darf gering sein * Zellabtrennung + Abreicherung von Kontaminanten (Endotoxine, DNA etc.)
30
Zellabtrennung: Arten der Filtrationsprozesse
* Dead-End Filtration als Batch-Prozess * Crossflow Filtration als dynamischer Prozess
31
Arten der Filtration nach der Porengröße des Filters
* Mikrofiltration * Ultrafiltration * Nanofiltration * Reverse Osmose
32
Arten der Produktreinigung
* Fällung * Extraktion * Chromatographie * Filtration * Kristallisation
33
Funktion Fällung
* Makromoleküle werden durch geeignete Maßnahmen aus der Lösung in Partikel überführt * Weit verbreitet in der industriellen Chemie und Pharmazie * Erhöhung der Salzkonzentration → Hydrathülle der Proteine wird verringert → Proteine fallen aus (z.B. Natrium- oder Ammoniumsulfat-Fällung) * Eventuell in Verbindung mit Hitze * Seltener: Fällung über den pH-Wert → geringste Löslichkeit am isoelektrischen Punkt * Schnell * Unspezifisch (viele Verunreinigungen!)
34
Funktion Extraktion
* Flüssigphasen-Extraktionssysteme → Verteilung zwischen einzelnen, nicht mischbaren Phasen (wässrig-organisch; wässrig-wässrig) * Penicillin, Steroide, Vitamine werden so gereinigt * Schütteltrichter
35
Funktion Chromatographische Methoden
* Chromatographiesysteme lassen sich auf einzelne Reinigungsprobleme gut anpassen * Feststoffpartikel in eine Säule gefüllt (**stationäre Phase**) * Zu trennende Moleküle befinden sich in einem geeigneten Lösungsmittel (**mobile Phase**) * Unterschiedliche Verweilzeiten führen zu Komponententrennung * Schonende Trennung: niedrige Scherkräfte, RT oder 4°C, gepufferte Lösungen
36
Arten chromatographischer Methode? Worauf basieren sie?
* Adsorptionschromatographie → Polaritätsunterschiede zw. fester und flüssiger Phase * Verteilungschromatographie → z.B. Hydrophobic interaction chromatoraphy * Ionenaustauschchromatographie → basiert auf elektrostatischen Wechselwirkungen * Gelchromatographie → Trennung aufgrund der unterschiedlichen Größe * Affinitätschromatographie → Verwendung von hoch selektiven Bindungsgruppen
37
Produktreinigung: Arten der Filtration? Was kennzeichnen sie aus?
**Ultrafiltration** * dynamisches System * Überströmen der Membran * Pufferaustausch, Aufkonzentrierung **Sterilfiltration** * Mikrofiltration * Letzte Filtration vor der Abfüllung * Dead-End Filtration
38
Funktion Kristallisation
* Gezielte temperatur- oder druckgesteuerte Evaporation des Lösungsmittels * Produkt wird in Reinform kristallisiert * Physikalische Abtrennung von nicht-kristallierenden Verunreinigungen * Einsatz bei kleinen (Vitamine) und komplexen (Antikörper) Molekülen
39
Methoden der Kontaminanten-Inaktivierung
* Nicht nur eine Entfernung der Kontaminanten (Chromatographie, Filtration), sondern auch eine Inaktivierung ist notwendig (z.B. Viren) * pH- und Lösungsmittelbasierte Inaktivierung von Viren * Ethanol, pH 2-3 bei der Antikörperaufreinigung * Entscheidend: Stabilität des Produktes + Inaktivierungsrate des Virus * Andere Methoden: Hitze, UV-Strahlung, Ultraschall*

Angewandte Mikrobiologie (14 decks)

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