02a Anreicherung und Aufbewahrung von Mikroorganismen Flashcards
Isolierung und Anreicherung von MOs Die Reinkultur
1
Q
Warum sollte man MOs kultivieren?
A
- einzige Möglichkeit, um Merkmale vollständig zu charakterisieren
- Einfluss auf den Lebensraum vorhersagen
- Wissenschaftliche Experimente
- Kultursammlung
- Industrielle Zwecke
2
Q
Nenne die Schritte für die Kultivierung von MOs
A
- Ursprungsmaterial
- Isolierung
- Anreicherungskultur
- Reinkultur + Kontrolle
- Analyse und Aufbewahrung –> erreichen des Ziels
3
Q
Arten der Isolierung
A
- Mischpopulation
- Direktisolierung
- Selektive Einzelisolierung
4
Q
Arten der Analyse einer Kultur
A
- makroskopisch
- mikroskopisch
- phänotypisch
- genotypisch
5
Q
Beschreibe die Direktisolierung
A
- Bedingung, damit man eine Direktisolierung durchführen kann: gewünschter Organismus muss mit einem großen Anteil in der Mischpopulation vorhanden sein
- bei vielen MOs möglich (z.B. Bacillus subtilis [weil strikt aerob])
- führt nicht unbedingt zu einer Reinkultur (aber leichter zu erzielen)
- bei Direktisolierung kann man den Schritt Anreicherungskultur übergehen, ist aber die Individuenzahl in der Mischpopulation sehr gering, muss eine Anreicherungskultur gemacht werden
6
Q
Prinzip der Anreicherungskultur
A
bestimmte, selektive Umweltbedingungen schaffen, die das Wachstum des gewünschten Organismentyps begünstigen, während sie die Entwicklung aller anderen, unerwünschten Organismen hemmen
7
Q
Schritte um eine Anreicherungskultur zu erhalten
A
- Natürliche, ökologische Nische
- Ursprungsmaterial
- Probensammlung
- Inokulum/Animpfmaterial
- Selektivmedium, spezifische Bebrütungsmedium
- Anreicherungskultur
- Künstliche, ökologische Nische
8
Q
Anreicherungskultur: Schwierigkeiten
A
- Isolierung eines bestimmten MO -> setzt die genaue Kenntnis der Nährstoffansprüche und (optimalen) Bebrütungsbedingungen voraus
- Bias - “Survival of the fastest”
9
Q
Anreicherungskulturen: Möglichkeiten
A
- Unbegrenzte Zahl an Kombinationen verschiedener Nährstoffe, Hemmstoffe und Bebrütungsbedinungen
- Isolierung aller MOs mit jeder gewünschten physiologischen Eigenschaft (sehr essenziell für Pathologie)
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Q
Nenne 3 phototrophe Bakterien und wichtige Informationen zu deren Kultivierung für die Anreicherung
A
Cyanobakterien:
* aerobe Inkubation
* N2 als Stickstoffquelle
Purpurschwefelbakterien, Grüne Schwefelbakterien
* anaerobe Inkubation
* H2S als Elektronendonor
11
Q
Nenne 2 chemolitotrophe Bakterien und wichtige Informationen zu deren Kultivierung für die Anreicherung
A
Nitritoxidierende Bakterien
* aerobe Inkubation
* NO2 als Elektronendonor
Wasserstoffbakterien
* Aerobe Inkubation
* H2 als Elektronendonor
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Q
Nenne 2 Bakterien und wichtige Informationen zu deren Kultivierung für die Anreicherung
A
Acetobacter
* Ethanol als Elektronendonor
* Hefeextrakt als Stickstoffquelle
* Aerobe Atmung
Escherichia
* Glucose/Lactose als C-Quelle
* NH4+ als Stickstoffquelle
* Fermentation
13
Q
Was ist MEA?
A
= Malt Extract Agar
* Agar zur Kultivierung von Schimmelpilzen
* Agar mit hohem Feuchtigkeitsgehalt und niedrigem pH-Wert
14
Q
Was ist die Winogradsky-Säule und wofür wird sie eingesetzt?
A
- artifizielles Ökosystem im Miniaturformat
- Möglichkeit der Anreicherung von MOs
- gute Quelle zum Animpfen von Anreicherungskulturen
- Isolation von phototrophen Bakterien, sulfatreduzierenden Bakterien und vielen Anaerobiern
- leichte Verfügbarkeit von verschiedenen MOs
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Q
Wie ist eine Wiogradsky-Säule aufgebaut?
A
- Glaszylinder mit Alufolie oder Parafilm als Deckel (leicht geschlossen, nicht luftdicht)
- oberer Bereich: Wasser (Teich, See, Meer): Sauerstoffgehalt nimmt nach unten ab
- Algen und Cyanobakterien auf Wasseroberfläche und unmittelbar drunter: bilden Sauerstoff => dieser Bereich bleibt oxisch
- unterer Bereich: 1/3 bis zur Hälfte Schlamm, sehr dicht gepackt -> anoxisch
- Fermentative Zersetzungsprozesse im Schlamm -> Bildung von organischen Säuren, Alkoholen und H2 (Substrate für sulfatreduzierende Bakterien)
- Sulfatreduzierende Bakterien bilden H2S -> Entwicklung von Purpurschweflebakterien und grünen Schwefelbakterien
- (Die pigmentierten Zellen der anoxygenen Photographen kann man mit einer Pipette als Probe sammeln, isolieren und charakterisieren)
- Allgemein: es entwickelt sich eine vielfältige Gemeinschaft von Organismen
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Q
Inokulum: Definition und Beschreibung
A
- = gewisse Menge an vermehrungsfähiger (lebender) MOs
- Inokulum kann entweder Mischpopulation oder Reinkultur etc. sein
- Voraussetzung für eine erfolgreiche Anreicherungskultur
17
Q
Anzahl der überimpften Zellen hängt ab von …
A
- Art des Zellmaterials
- Ziel der Kultivierung
- Kleines Inokulum für die Gewinnung von Reinkulturen
- Großes Inokulum für eine kurze Lag-Phase bei nährstoffarmen Medien
18
Q
Überimpfen: Definition
A
= Übertragung einer gewissen Menge vermehrungsfähiger MOs auf oder in einen (meist sterilen) Nährboden zum Zweck der Kultivierung
19
Q
Grundregeln des Überimpfens
A
- unter aseptischen Bedinungen
- in der Nähe der Flamme oder in einer sterilen Werkbank arbeiten
(hängt vom Equipment aber auch von den Organismen ab) - alle Kulturgefäße müssen VOR dem Beimpfen eindeutig beschriftet werden
- Nährboden oder Dispersionsmittel im Kühlschrank vor dem Beimpfen auf RT oder auf die Bebrütungstemperatur bringen
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Q
Zähle das benötigte Equipment für das Überimpfen auf
A
- Impföse
- Impfnadel
*Drigalski-Spatel
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Q
Wann wird die Impföse eingesetzt?
A
- Zur Entnahme kleiner, meist genau definierter Mengen an Kulturmaterial (1-10 µL)
- Für Bakterien und Hefen geeignet
- Zum Beimpfen kleinerer Flüssigkeitskulturen und der Oberfläche fester Nährböden
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Q
Impföse: Eigenschaften und Anwendung
A
- aus Platin-Iridium-Draht oder hochglühfähigem Edelstahl-Drat
- 0,5-0,6 mm Drahtstärke, 60 mm lang, Ring mit 2-4 mm Durchmesser (möglichst völlig
geschlossen und absolut eben) - Der Griffteil des Halters ist nur zur Wärmeisolierung mit Kunststoff überzogen
- Durch Ausglühen sterilisiert
- Für den Ausstrich auf Agarplatten wird der Ring ganz leicht angewinkelt
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Q
Impfnadel: Wann wird es eingesetzt?
A
- Zur Übertragung sehr kleiner Inokula
- zur Entnahme von Material aus kleinen oder dicht nebeneinanderliegenden Kolonien
- zum Animpfen von Stichkulturen
- zur Kultivierung von Schimmelpilzen
24
Q
Impfnadel: Eigenschaften und Anwendung
A
- Ist am Ende nicht gebogen, sondern gerade und meist zugespitzt
- 50-70 mm lang
- Durch Ausglühen sterilisiert
25
Drigalski-Spatel: Wann wird es eingesetzt?
Zum gleichmäßigen Verteilen (Ausplattieren) keimhaltiger Suspensionen auf der
Oberfläche von Agarplatten → z.B. Lebendzellzahlbestimmung nach dem
Spatelplattenverfahren
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Drigalski-Spatel: Eigenschaften und Anwendung
* Runder Glasstab mit 5-6 mm oder Edelstahlstab mit 3 mm Durchmesser
* Unteres Ende ist im rechten Winkel oder durch zweimaliges Umbiegen zu einem Dreieck
gebogen
* Sterilisation durch Abflammen
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Unterschied zwischen Ausstreichen und Ausplattieren?
Ausstreichen ≠ Ausplattieren!
* Ausstreichen mit Impföse oder Impfnadel
* Ausplattieren mit Drigalski-Spatel
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Das Ergebnis einer Anreicherungskultur
* einige bringen kein Ergebnis
- keine passenden Bedingungen
- Wunsch-Organismus nicht in der Probe vorhanden
* die Anreicherung ist niemals eine Reinkultur -> Gemisch verschiedener MOs
* Selektion der Schnellwachsenden
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Was versteht man unter Selektion der Schnellwachsenden?
* survival of the fastest: die am schnellsten wachsenden Organismen dominieren
* machen oft nur einen geringen Anteil an der mikrobiellen Gemeinschaft aus
* Diese Bevorzugung kann manchmal sogar recht stark eintreten → am stärksten in flüssigen
Anreicherungskulturen
* Mögliche Ursache: höhere Konzentrationen an Ressourcen in der Laborkultur
* Dominanz wird deutlich beim Vergleich einer Anreicherungskultur mit
einer Verdünnungskultur
Die schnellwachsenden Organismen haben in der Laborkultur oft einen Vorteil gegenüber anderen (langsam wachsenden), weil die Bedingungen – wie z. B. die hohe Nährstoffkonzentration – ihnen besonders gut passen. Dadurch können sie sich stärker vermehren und dominieren die Kultur, obwohl sie in der ursprünglichen mikrobiellen Gemeinschaft nur einen kleinen Anteil ausgemacht haben.
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Warum wird eine Verdünnungskultur gemacht?
* Dadurch entwickeln sich Organismen, die häufiger in der Gemeinschaft vorkommen, aber
langsamer wachsen
* so wird das Phänomen "Survival of the Fastest" umgangen
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Wie wird eine Verdünnungskultur erstellt?
Durch mehrmaliges Ausstreichen von Zellmaterial aus der Anreicherungskultur auf einen
festen Nährboden oder durch Reihenverdünnung mit Schüttelagarkulturen kann man den
angereicherten Stamm in den meisten Fällen isolieren
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Methoden zur selektiven Einzelzell-Isolierung
* Laserpinzette
* Durchflusszytometrie
* Hochdurchsatzkultur
* Mikrofluidische Geräte
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Funktionsweise + Skizze, Einsatz: Laserpinzette
* Lichtmikroksop + stark fokussierter Infrarotlaser
* Der Laserstrahl baut eine Kraft auf, welche eine mikrobielle Zelle auf einer Position
festhalten kann
* Mischprobe in einem Kapillarröhrchen → eine einzelne Zelle kann **optisch gefangen** und von kontaminierenden Organismen entfernt werden
* Zelle wird isoliert → Brechung des Röhrchens zwischen Zelle und Kontamination und die Zelle wird in ein Röhrchen mit sterilem Medium gespült
* Besonders nützlich für die Isolation von langsam wachsenden Bakterien
* Zur Identifizierung bestimmter Organismen (z.B. mithilfe von Anfärbemethoden)
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Wie funktioniert die Durchflusszytometrie?
* zum **Zählen** und Untersuchen mikroskopischer Partikel
* Leitung durch einen elektronischen Detektor →
Sortierung nach definierten Kriterien (**Größe, Form,
Fluoreszenzeigenschaften**)
* Isolierung von Einzelzellen + Anreicherung von Zellen mit spezifischen Eigenschaften
* Die **Zellsorter** können Einzelzellen in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte ablegen, wobei die Vertiefungen entweder alle das gleiche Medium enthalten oder leicht unterschiedliche Wachstumsmedien
* Jede Vertiefung wird dann auf Wachstum oder andere Eigenschaften untersucht, die man manuell oder auch robotisch durchführt
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Wie funktioniert die Hochdursatzkultur?
* Basierend auf **Verdünnung oder Zellsortierung**: Einzelne Zellen werden getrennt kultiviert (z. B. in Mikrotiterplatten). -> 1 Zelle pro Vertiefung
* Individuelle Analyse: Jede Vertiefung (Well) wird auf Wachstum oder das Vorhandensein bestimmter Gene untersucht.
* Paralleles Testen vieler Bedingungen: Unterschiedliche Nährstoffe, Temperaturen oder pH-Werte können gleichzeitig getestet werden – das simuliert die natürliche ökologische Nische und vermeidet Konkurrenz zwischen Mikroorganismen.
* zeigt steigenden Erfolg für die Kultivierung besonderer Bakterien (z.B. Beim marinen Planktonbakterium **Pelagibacter**)
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Warum wird Pelagibacter mittels Hochdursatzkultur kultiviert?
* (Eines der häufigsten Bakterien auf unserer Erde)
* Wächst nur auf stark verdünnten organischen Substanzen - Hochdursatzkultur beruht auf Verdünnungen
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Wie funktionieren mikrofluidische Geräte?
* Enthalten Kanäle und Vertiefungen zum Flüssigkeitstransfer im absoluten Miniaturmaßstab
* Weniger als 10 cm lang; enthält 3200 Vertiefungen im nL-Maßstab, wobei jede Vertiefung
als extrem kleines Kulturgefäß dient
* Eine Umweltprobe wird in den Apparat so eingespeist, dass pro Vertiefung eine Zelle vorliegt
* Unterschiedliche Medienformulierungen
gleichzeitig testen
* Test auf Wachstum und/oder das
Vorhandensein spezieller Gene
* Das Wachstum wird mikroskopisch kontrolliert
* Inkubation für einen Monat oder länger
* Isolation von (positiven) Mikroben
* Nachfolgende Weiterzüchtung im Labor
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Definition: Reinkultur
= Population von MOs, die aus einer einzelnen Zelle hervorgegangen ist und frei ist von andersartigen MOs (Kontaminationen)
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Warum werden Reinkulturen gemacht?
* Grundlage für Laboruntersuchungen an MOs, Aufbewahrung und Konservierung von MOs und für industrielle Zwecke
* Nur bei einer Reinkultur kann man vom Verhalten der Population auf das Verhalten des einzelnen Organismus schließen
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Sind Reinkulturen genetisch homogen oder heterogen?
* Reinkulturen bestehen nicht notwendigerweise aus genetisch identen Individuen
* -> häufig Mutationen
* geringfügige genetische Heterogenität wird akzeptiert
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Wie wird eine Reinkultur allgemein gewonnen?
2 Schritte:
* **Vereinzelung** von Individuen einer
gemischten Population
* **Vermehrung** von vereinzelten
Individuen
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Wie wirk sich die Art des Nährbodens auf die Reinheit der Reinkultur aus?
* verwendet man keinen Selektivnährboden, ist die Wahrscheinlichkeit viel höher, dass versteckte Kontaminationen vorhanden sind
* verwendet man allerdings dennoch Universalböden, muss dies kombiniert werden mit einer längeren Bebrütung, um dennoch langsam wachsende Kontamination zu entdecken
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Methoden zur Gewinnung von Reinkulturen
* Ausstrichmethode
* Agarverdünnungsröhrchen-Methode
* Most-Probable-Number-Technik
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Für welche MOs ist die Ausstrichmethode geeignet? Wie funktioniert die Ausstrichmethode?
* geeignet für jeden Organismus, der auf Agarplatten Kolonien bildet
* Zweck: Die Ausstrichmethode dient dazu, aus einer Mischung von Mikroorganismen Einzelkolonien zu gewinnen – also Kolonien, die aus nur einer Zelle hervorgegangen sind und somit eine Reinkultur darstellen können.
Grundprinzip:
* Eine Zellsuspension (z. B. aus einem Flüssigmedium) wird mit einer sterilen Impföse auf einer Agarplatte ausgestrichen.
* Ziel ist es, die Zellen schrittweise zu verdünnen, damit sie vereinzelt wachsen können und isolierte Kolonien bilden.
**Verdünnungsaustrich**
* a einfachsten und gebräuchlichste Methode zur Isolierung von Bakterien und Hefen
* Man streicht mehrfach über die Agarplatte, wobei der Zellgehalt nach und nach abnimmt.
* In den späteren Bereichen erscheinen Einzelkolonien,
* Wichtig: Die Agaroberfläche muss trocken sein, sonst „verschmieren“ die Zellen, und man bekommt keine sauberen Kolonien.
* Problematisch bei „schwärmenden“ Bakterien, die sich schnell über die ganze Platte ausbreiten.
**13-Strich-Verfahren**
* Kleine Menge der Zellsuspension wird mit einer sterilen Impföse in mehreren Serien
paralleler Striche auf einer Agarplatte ausgestrichen
* Nach jedem dritten Bereich (1–3, 4–6 etc.) wird die Impföse ausgeglüht (sterilisiert), sodass die Zellanzahl weiter abnimmt.
* Zunehmende Verdünnung des Inokulums auf der Agarplatte
* Führt schnell zu einer starken Verdünnung
* Kein komplettes Wachstum notwendig
* Fraktionierter Ausstrich erhöht den Verdünnungseffekt
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Ausstrichmethode: Welche möglichen Ursachen gibt es dafür, warum keine Vereinzelung stattfindet
* Agaroberfläche war zu feucht
* Vergessen Zellmaterial zu suspendieren
* Zu viel Zellmaterial
* Vergessen Impföse nach jeder Strichserie auszuglühen (13-Strich-Verfahren)
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Wie funktioniert die Agarverdünnunsröhrchen-Methode? Wann wird sie am häufigsten eingesetzt?
* Verdünnung einer Mischkultur in Röhrchen mit **geschmolzenen Agar**
* Die Kultur wird durch aufeinander folgende Verdünnungsschritte von Zellsuspensionen in Röhrchen mit geschmolzenem Agar gereinigt
* nützlich zur Reinigung anaerober Organismen aus Proben einer Winogradsky-Säule
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Wie funktioniert die Most-Probable-Number-Technik (MPN)?
* serielle Verdünnung des Animpfmaterials in einem flüssigen Medium
* zum Erhalt von Reinkulturen UND zur Bestimmung der Lebendkeimzahl
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Warum ist eine Reinheitskontrolle der Reinkultur notwendig?
Der Erfolg aller nachfolgenden Untersuchungen an einem Organismus hängt von der Reinheit des verwendeten Zellmaterials ab!
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Wie kann die Reinheit einer Reinkultur kontrolliert werden?
* Die Kolonien eines Reinkultur-Ausstrichs **müssen ident sein**
* Mikroskopie, Kolonie-Morphologie, Untersuchung des Wachstumsverhaltens
Beachte:
* Kolonie-Morphologie kann sich bei einem Mediumwechsel ändern
* Der Kolonie-Durchmesser ist u.a. abhängig von der Koloniedichte in ihrer Umgebung, d.h auch wenn Kultur rein: Durchmesser kann variieren
* Kolonien, die nicht auf den Strichen liegen (bei einer Ausstrichplatte), stammen im Allgemeinen von Kontaminanten aus der Luft
* versteckte Kontaminationen -> Verwendung von den passenden Kulturmedien (ig Selektivmedium verwenden?)
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