UE1B-17 Les Méthodes d’études et Techniques Histologiques Flashcards
Définition : Histologie
= Étude de la structure NORMALE (macroscopique et microscopique ) des organismes vivants et des rapports entre structures et fonctions.
→ des tissus et cellules normaux.
Par quelle autre discipline se prolonge l’Histologie ?
- l’Anatomopathologie : Anatomie et Cytologie pathologique, pour les tissus et cellules ANORMAUX.
Définition : Tissu
= Cellules + MEC (matrice extracellulaire)
Qu’analysent l’histologiste et l’anatomo-pathologiste ?
=> Différents prélèvements Solides ou Liquides.
Qu’utilise-t-on s’il s’agit de fragments solides ?
Des techniques histologiques.
Qu’utilise-t-on s’il s’agit d’un prélèvement liquide ou de cellules isolées ?
Des techniques cytologiques.
Quels sont les autres disciplines morphologiques ?
- l’Anatomie Humaine
- l’Histologie-Embryologie-Cytogénétique
- l’Anatomie et Cytologie Pathologiques
Quelles sont les autres disciplines voisines de l’Histologie Humaine ?
- la Biologie Cellulaire
- l’Hématologie
- la Biologie Médicale
- l’Immunologie
- la Médecine légale
Quelle est l’importance de la cellule ?
= l’unité fondamentale du corps humain.
De quoi est capable la Cellule ?
- de survivre en autonomie
- d’interagir avec son environnement
- PARFOIS de se reproduire
Combien y’a-t-il de cellules chez l’adulte ?
Environ + de 60 000 milliards de cellules.
Définition : Cellules Différenciées
= les plus nombreuses dans le corps humains, elles ont un rôle physiologique spécifique.
Certaines n’ont plus de noyau : ne peuvent donc plus se diviser.
→ elles sont en différenciation terminale
Définition : Cellules Indifférenciées
= moins nombreuses SAUF pendant les premières semaines de développement.
→ pas encore de fonction spécifique.
Quelles autres cellules existe-t-il ?
- En cours de différenciation
- Partiellement différenciées
- Dédifférenciées
Comment peut être la MEC ? (3)
° Dure : Os, Dents
° Plus ou moins molle : Fibres
° Liquide : Tissu Sanguin
Quels sont les 4 grands types de tissus ?
- Épithéliaux
- Musculaires
- Nerveux
- Conjonctif
Définition : Organe
= Assemblage de différents tissus
Définition : Viscères
= Organes présents dans les cavités du corps (thoraciques ou abdominales), recouvert de mésothélium.
Définition : Mésothélium
= tissu qui leur permet de glisser les uns sur les autres et/ou de se déformer rapidement.
Quels types de viscères existe-t-il ?
- Viscères Creux : les Poumons / l’Estomac / le Colon
→ possèdent une ou plusieurs cavités anatomiques. - Viscères Pleins : le Foie / la Rate
→ possédant aucune cavité anatomique.
Définition : Systèmes
= Assemblage d’organes et de tissus formant un ensemble, ayant une fonction précise.
Le plus souvent sur quels individus sont prélever les tissus nécessaires pour la prise en charge médicale ?
Le plus souvent sur des individus VIVANTS, pour diagnostiquer et classifier.
Par quoi est évaluée la balance bénéfices/risques ?
- L’estimation des bénéfices attendus après le prélèvement
- L’estimation des risques possibles pendant le prélèvement
- La connaissance des processus de cicatrisation ou de lésion de la zone prélevée
Définition : Prélèvement
= processus de dégradation ou d’autolyse.
Que faut-il alors faire avant tout gestes de prélèvement ?
- il faut s’assurer qu’on dispose d’un circuit conforme à une analyse correcte avant de prélever.
Définition : Exérèse chirurgicale d’un organe
= Ablation totale ou partielle d’un organe pour son analyse histologique.
Nomenclature de l’Exérèse
Nom de l’organe (ou d’une racine commune) + suffixe «-ectomie».
Exemples d’Ablations : Colon / Estomac / Testicules
° Colon : Colectomie
° Estomac : Gastrectomie
° Testicules : Orchidectomie
L’exérèse correspond à quel type d’opération ?
=> opération lourde, programmée, irréversible et provoquant des séquelles.
- combine une partie thérapeutique + une partie diagnostique/de classification.
Que réalise-t-on sur l’organe excisé ?
=> des tests théranostiques : permettent de dégager des informations sur la réponse (ou non) à des thérapies.
Concernant l’Exérèse chirurgicale…
Plus rarement : se fait en urgence pour des cas cliniques graves et imprévue.
→ l’approche Thérapeutique prédomine sur l’approche Diagnostique.
Concernant les organes ne bénéficiant jamais d’une exérèse totale sur patient vivant…
- le cerveau
→ peuvent être prélevés post-mortem lors d’autopsies.
Que se passe-t-il dans le cadre d’une transplantation d’organe ?
Les organes vitaux (cœur / poumons) sont totalement prélevés sur le patient vivant, puisqu’ils seront remplacés.
=> Transplantation
Définition : Biopsie
= prélèvement d’un petit bout d’organe (quelques mm à quelques cm) à visée diagnostique.
- Plus le cite est facile d’accès, plus on pratique la biopsie.
Qui réalise la Biopsie ?
- le Spécialiste de l’organe concerné.
- un Radiologue ou un Chirurgien pour les zones difficiles d’accès.
Définition : Ponction d’organe plein
= prélèvement de cellules
- permet de faire un diagnostic cytologique mais pas histologique car la ponction détruit la structure du tissu.
Définition : Ponction liquide
= prélèvement de sang / autres liquides présents dans notre organisme.
Quels sont les autres moyens de prélèvement cytologiques ?
- Grattages
- Frottis
- Brossages
→ à l’aide d’outils divers pour recueillir des cellules sur la surface d’une zone suspecte.
=> peu invasifs : pour dépister des cancers de manière précoce.
Concernant le parcours du prélèvement…
Il est méconnu du grand public.
Que se passe-t-il au niveau des échantillons histologiques et cytologiques ?
=> Subissent un processus de dégradation, nécessitent donc une prise en charge rapide et optimisée pour permettre une exploitation diagnostiqu.
En fonction de quoi varie la prise en charge des échantillons ?
- du type de prélèvement
- de la situation clinique
Que faut-il faire dans un premier temps avant la prise en charge ?
ANTICIPER :
- A t-on besoin de réaliser un examen extemporané (diagnostic urgent) ?
- A t-on besoin des techniques non réalisables après une prise en charge de routine ?
Définition : État frais
= étude de la pièce opératoire avant la fixation.
- permet de décider de la mise en place de procédures optionnelles qui ne pourront plus être réalisées une fois la fixation débutée :
- congélation à visée sanitaire ou à visée de recherche
- examen en microscopie électronique
- apposition cellulaire
- réalisé par un médecin dans un environnement spécialisé (labo, bloc).
- urgence (si il est nécessaire), doit être réalisé le plus rapidement possible.
Définition : Examen Extemporané
- demandé par le chirurgien, dont le résultat aménage le geste opératoire.
=> une URGENCE dans le cadre d’une intervention chirurgicale programmée.
Quels sont les 2 cas de figures de l’Examen Extemporané ?
1) le chirurgien veut savoir si il a affaire à une tumeur cancéreuse ou non : pour élargir le geste chirurgical ou le limiter pour préserver les structures saines.
2) le chirurgien réalise une analyse de la limite d’exérèse : il veut savoir si il a enlevé toute la tumeur → peut faire courir un risque supplémentaire pour le patient avec des gestes supplémentaires au niveau des structures saines.
À partir de quoi un Examen Extemporané peut-il être réalisé ?
À partir de coupes de tissus congelés : Cryocoupes / d’une Analyse Cytologique : lames d’apposition / ou des 2 approches combinées.
Définition : Appositions
→ on met en contact le tissu avec une lame de verre pour que les cellules les plus externes se détachent et restent apposées à la lame.
- Puis les lames d’appositions sont fixées et colorées rapidement permettant une interprétation en quelques minutes.
Définition : Cryocoupes
= fragment (de quelques mm de côté) congelés à -70°C, puis réchauffé entre -20°C et -30°C, ensuite coupé en tranches fines (à l’aide d’un cryostat) de 5 à 10 um d’épaisseur.
- puis les Cryocoupes sont rapidement fixées et colorées permettant une interprétation histologique en quelques minutes.
Que permet la Congélation d’un prélèvement tissulaire frais ?
=> permettre la préservation du prélèvement à long terme tant que la chaîne du froid est respectée.
- Congélation rapide : à - 70°C ou à température inférieure.
- Fragments conservés : à - 80°C ou à température inférieure.
Que provoque le réchauffement d’un tissu congelé ?
→ Entraine la reprise des processus d’autolyse.
Pourquoi congeler les prélèvements ? (2)
- extraire les composants tissulaires de qualité : protéines, ARN, ADN : pour des études moléculaires non morphologiques.
- réaliser des Cryocoupes au cryostat : permettant après colorations ou techniques spéciales des études morphologiques.
Définition : FIXATION
- Après l’État frais : fixer rapidement le prélèvement.
- Permet de stopper la dégradation du tissu et de figer les composants moléculaires.
- Immersion du prélèvement dans le fixateur en large excès : Formol Neutre Tamponné → paraformaldéhyde à 4% avec tampon permettant de maintenir un pH neutre.
° les grosses pièces doivent être ouvertes pour que le fixateur puisse pénétrer à l’intérieur du prélèvement.
Quelle est la durée de fixation suffisante ?
Minimum 6 heures et pas plus de quelques jours.
Quelle est la conséquence de la fixation ? (2)
- tuer les cellules et les micro-organismes
- détruire les activités enzymatiques tissulaires
Définition : Décalcification
= étape optionnelle, utile que pour les prélèvements calcifiés : os, dents, calcifications anormales.
- Immersion du prélèvement fixé dans une solution chélatrice du calcium : permet de ramollir les prélèvements pour qu’il puisse être coupé en fine tranche par le michrotome.
Définition : Macroscopie
- se fait sur une pièce opératoire fixée
- permet de :
° photographier le prélèvement
° d’identifier à l’œil les zones d’aspect lésionnel / non nécrotiques
° sélectionner des fragments d’intérêts pour l’inclusion en paraffine.
= procédures standardisées.
Quelle est la taille maximale de l’échantillon ?
30 mm x 20 mm x 4 mm
Définition : Inclusion en paraffine
= pour rigidifier l’échantillon : étape de durcissement
→ donner une consistance ferme pour permettre la coupe.
Étape de l’Inclusion en Paraffine
1) Dans les Automates pendant plusieurs heures :
- déshydratation
- clarification (dans les solvants)
- imprégnation (par la paraffine liquide à 57°C) : pour éliminer le fixateur
2) Manuellement :
- l’échantillon est ensuite placé en sandwich entre une cupule métallique remplie de paraffine chaude qui déborde à sa partie supérieure dans la cassette plastique.
On verse de la paraffine qui va déborder dans le compartiment de la cassette plastique.
Quand la paraffine est solidifiée, on désolidarise la cupule métallique et on obtient un bloc de tissu fixé et inclus en paraffine.
Combien de temps peut-on conserver le bloc de tissu fixé et inclus en paraffine ?
À température sur plusieurs décennies.
Comment est la cassette en plastique après l’inclusion en paraffine ?
- porte les données relatives aux prélèvement
= indissociable au prélèvement grâce à la paraffine solide.
Définition : Coupe
- le bloc est fixer au microtome grâce à la cassette en plastique.
→ réalise des coupes de 3-5 um d’épaisseur.
Les coupes sont recueillies et étalées sur une ou plusieurs lames de verres identifiées, puis chauffées pour consolider leur adhésion à la lame de verre.
- peuvent être gardées quelques semaines à température ambiante avant leur utilisation.
Définition : Coloration ou les Autres Techniques Histologiques
° Dans 1 premier temps :
Déparaffinage (dans un solvant) → Réhydratation (dans de l’alcool de - en - concentré)
=> COLORATION
° Ensuite :
Déshydratation (dans de l’alcool de + en + concentré) → Montage (dépose une lamelle de verre et un milieu de montage = colle)
Avec quoi fait-on l’interprétation ?
=> un Microscopique Optique ou un autre type de microscope si besoin et en fonction du traceur utilisé.
Concernant les Grossissements utilisés…
- Varient de x1 à x600 pour des objectifs à SEC.
- Varient de x600 à 1000 pour des objectifs à IMMERSION : nécessite le dépôt d’une goutte d’huile à la surface de la lamelle.
Concernant l’interprétation dans le cadre de la prise en charge médicale…
=> un compte rendu d’analyse est rédigé pour tout examen, signé par le pathologiste ayant supervisé la technique et réalisé l’interprétation.
En combien de temps et en fonction de quoi se fait le rendu d’un résultat ?
En fonction de la difficulté et du nombre de techniques réalisées, le rendu d’un résultat se fait entre 24h et quelques jours.
Que fait-on avec la partie non utilisée du prélèvement ?
Après la microscopie : elle est conservée dans le fixateur jusqu’à finalisation du compte rendu puis incinérée.
Et que fait-on avec les blocs de tissus fixée et inclus en paraffine ?
Ils sont conservés à température ambiante au moins 10 ans dans les laboratoires privés et au moins 20 ans dans les structures publics.
→ peuvent être réutilisés des dizaines d’années après leur confection.
Concernant la prise en charge des prélèvements cytologiques…
- Dilution ou Cyto-centrifugation : diluer ou enrichir la concentration cellulaire des liquides.
- Coloration : réalisée directement sans déparaffinage.
- si utilisation non-immédiate : les lames de cytologie peuvent être congelées ou fixées pour permettre le conservation.
Concernant les colorations…
Il existe une panoplie de colorations utilisées en histologie dont la Coloration HES (Hématéine-Éosine-Safran.
→ les colorations s’appliquent à tous types de lames (tissus fixés, cytologie et tissus congelés).
Quelle est la coloration la plus utilisée en France ?
La coloration HES (Hématéine-Éosine-Safran) qui associe 3 colorants appliqués successivement.
Définition : Hématéine
= colorant basique (pH > 7) qui va se fixer sur les structures acides des cellules et tissus.
→ colorer en BLEU / BLEU SOMBRE.
Concernant ces structures acides…
Elles sont «Basophiles», on y retrouve :
- les noyaux des cellules, dû à la présence d’Acides nucléiques (ADN)
- les régions cytoplasmiques : riches en Réticulum Endoplasmique Granuleux = lieu de la traduction des ARNm en protéines => donc structure Acide
Définition : Éosine
= colorant acide (pH < 7) qui va venir se fixer sur les structures basiques (pH > 7).
→ colorer en ROSE.
Concernant ces structures basiques…
Elles sont Acidophiles/Éosinophiles, on y retrouve :
- régions riches en protéines : cytoplasme des cellules et/ou MEC de certains tissus.
Quels colorants se fixent assez rapidement ?
L’Hématéine et l’Éosine : se fixent très rapidement sur leurs structures correspondantes.
→ Safran très peu voire quasiment pas utilisé, on se contactera de la coloration HE pour donner notre résultat.
Définition : Safran
= colorant qui se fixe sur les collagènes de la MEC.
→ colorer en JAUNE-ORANGÉ.
- il ne fixerait rien si nous avions à faire à une cytologie : tel que la lame d’apposition
=> la cytologie ne permet pas l’appréciation de la MEC.
Définition : la PEAU
= un Organe : structure composée de plusieurs tissus : Épiderme & Derme.
Définition : Épiderme
= un tissu épithélial : non abondance de la MEC
→ colorant principaux qui se sont fixés :
- Hématéine & Éosine
Si on ne retrouve pas spécialement de coloration bleu sombre…
→ mais plutôt rose-violacée : c’est la coloration HE qui donne cette teinte.
- Si nous avions uniquement coloré les noyaux avec l’Hématéine : coloration prédominante => BLEU.
Définition : Derme
= tissu conjonctif : présence de Fibroblastes qui vont fabriquer du collagène TYPE 1.
→ coloration jaune-orangée : car richesse du derme en collagène.
Principes de base de l’Immunité
- Lorsqu’un agent étranger pénètre votre organisme, il est automatiquement détecté comme un élément à éliminer.
→ se met alors en place l’intervention de plusieurs agents concourant a l’élimination de cet agent = l’Immunité.
Quels sont les 2 cotés de l’Immunité ?
- Immunité Innée
- Immunité Adaptative
Définition : Immunité Adaptative
= une réponse longue qui comprends l’intervention de plusieurs agents, les principaux sont : les Lymphocytes B et les Lymphocytes T.
Que font les Lymphocytes B une fois en contact avec l’agent étranger ?
=> Une fois en contact avec l’Antigène : ils maturent en Plasmocytes => capables de produire des glycoprotéines = les Anticorps (= Immunoglobulines), capables à l’aide d’autres cellules, d’éliminer le pathogène dont il est question.
L’Immunité c’est quoi ?
La capacité de l’organisme à résister et à se défendre contre tout ce qu’il considère comme étranger.
L’Immunité Adaptative c’est quoi ?
Une forme d’immunité plus spécifique.
- repose sur la capacité du système immunitaire à reconnaître et à mémoriser les antigènes.
- elle comprend les LYMPHOCYTES B (plus précisément les plasmocytes) qui produisent des ANTICORPS pour cibler spécifiquement les envahisseurs.
Définition : Antigène
= Substance/Molécule (le + souvent une protéine) étrangère à un organisme étant capable de déclencher une réponse immunitaire.
Définition : Anticorps
ou Immunoglobulines = protéines hétéro-tétramérique, produites par le système immunitaire pour luter contre les agents étrangers.
Composé de :
- 2 chaînes lourdes
- 2 chaînes légères
Définition : Corps étranger
= tout ce qui n’est pas du soi, que l’organisme ne considère pas comme sien.
Où se lie le site de reconnaissance de l’antigène ?
(Il se situe sur l’anticorps)
→ se lie à l’épitope de l’antigène du corps étranger.
Définition : Épitope
= site de l’antigène où va venir se fixer l’anticorps.
C’est quoi la technique de l’IHC ?
= une méthode d’étude en histologie très utilisée possible sur tout type de lame.
- Permettent d’identifier, grâce à des anticorps issu d’une autre espèce que celle de l’homme, sur lame : des motifs antigéniques (des épitopes) qui correspondent le plus souvent à des protéines ou des glycoprotéines.
Quel est le but de l’IHC ?
De savoir si le prélèvement que l’on a/ la lame que l’on a en face de nous, il y a présence ou absence d’une protéine d’intérêt.
- permettra de conclure sur le potentiel caractère pathologique ou non de notre prélèvement.
Explication de la technique de l’IHC
- On introduit l’antigène (humain) d’intérêt au sein d’une espèce autre que celle de l’homme (espèce
animal). - Cet animal par son immunité adaptative a su développer des anticorps contre la protéine humaine d’intérêt.
- On récupère ces anticorps d’animal capable de reconnaître spécifiquement la protéine humaine qui nous intéresse.
- Si nous voulons savoir si cette protéine est présente ou non sur notre lame alors, nous introduisons ces anticorps sur notre lame d’intérêt :→ Si il y a observation d’un précipité coloré (dans le cadre de l’utilisation d’un traceur enzymatique) : l’anticorps s’est bien lié à son antigène et donc que la protéine est présente.→ Si non, la protéine est absente.
Comment appelle-t-on les anticorps issus d’un animal ?
- les Anticorps Polyclonaux
(moins spécifiques / plus sensible => reconnaissent plusieurs épitope d’un antigène.)
Comment appelle-t-on les anticorps produits in vitro ?
- les Anticorps Monoclonaux
(plus spécifique / moins sensible => reconnaissent 1 épitope d’un antigène.)
Qu’utilise-t-on pour pouvoir observer au microscope ou non l’association anticorps-épitope ?
Des traceurs liés à l’anticorps.
Que peut-on marquer en IHC ?
=> tout type de protéines :
Membranaires / Nucléaires / Cytoplasmique.
Quel est le but de l’Hybridation in situ (HIS) ?
=> Analyser la présence d’Acides Nucléiques d’intérêt à l’aide de Sondes Nucléotidiques complémentaires de la région cible et marquées par un traceur.
Que permet la présence du traceur associé à la sonde ?
Permet de localiser sur coupe : les complexes hybrides cibles - sondes.
Définition : Sondes Nucléotidiques
= un ensemble de petites séquences d’acides nucléiques, fabriquer au préalable afin que celles-ci puissent s’hybrider avec une séquence cible d’acides nucléiques permettant la mise en évidence ou non de cette séquence cibles d’acides nucléiques.
→ permet donc de détecter ou non la présence d’une séquence qui nous intéresse : gènes, région sujette à amplification/délétion, etc…
Quelles sont les étapes de l’Hybridation in situ (HIS) ?
- Dénaturation
- Hybridation
- Lavages
Définition : Dénaturation
= les sondes nucléotidiques sont pour la plupart fabriquer sous forme double brin : les rendre sous la forme simple brin.
Définition : Hybridation
= faire s’assembler les séquences (cibles et sondes) par complémentarité de base.
Définition : Lavages
= enlever l’excédent de sondes qui ne se sont pas hybridés avec la séquence cible.
Lors de l’Hybridation in situ (HIS) : si les séquences cibles sont des ARN messagers (ARNm) ?
- Permettre de : prouver une transcription active d’un ARN messager donné par un type cellulaire donné.
Cette approche est peu utilisée en routine et possède des applications en recherche : en neuro-histologie.
Lors de l’Hybridation in situ (HIS) : si les séquences cibles sont des ARN ou ADN viraux ?
- Permet de : visualiser les cellules infectées par l’agent viral.
Cette technique est de - en - utilisée en routine, car elle est remplacée par des techniques moléculaires non morphologiques (PCR et RT-PCR).
Lors de l’Hybridation in situ (HIS) : si les séquences cibles sont des ADN nucléaires ?
- Permet de : rechercher des anomalies de nombre de copie de séquence (délétions ou amplifications), et des translocations via l’ADN interphasique nucléaire.
= Techniques de FISH (= Hybridation In Situ en Fluorescence) : utilisées en routine mais pourraient être remplacées prochainement par des techniques moléculaires non morphologiques (CGH et recherche de transcrits de fusion par séquençage haut débit.)
Quels sont les 2 grands types de traceurs qui existent ?
- Traceurs enzymatiques
- Traceurs fluorescents
Quels traceurs sont utilisés en IHC ?
=> Traceurs enzymatiques : présent au niveau des complexes épitopes-anticorps, l’activité enzymatique apportée localement par le traceur permet en présence d’un substrat et d’un catalyseur la formation et le dépôt d’un précipité coloré à proximité.
Avantages de traceurs enzymatiques…
- interprétation en microscopie à fond clair
- intégration facile à la morphologie globale de la coupe
Inconvénients de traceurs enzymatiques…
- aspect quantitatif très grossier
- difficulté d’utiliser plusieurs traceurs enzymatiques différents simultanément
Quels traceurs sont utilisés en FISH ?
=> Traceurs Fluorescents
Avantages de traceurs fluorescents…
- approche quantitative (= importante pour les problématiques d’analyse de délétion et d’amplification)
- utilisation simultanée de plusieurs sondes différentes couplées à des traceurs différents (= important pour la détection de translocations chromosomiques)
Inconvénient de traceurs fluorescents…
- l’analyse doit se faire en microscopie fluorescente où seules les structures fluorescentes sont individualisables et rendant le repérage par rapport à la morphologie générale complexe.
