Secuenciación masiva de genomas Flashcards
Qué es la secuenciación?
Metodología basada en métodos bioquímicos para determinar el orden de las bases nitrogenadas en la cadena de ADN
Cuál es el fundamento de la secuenciación de Sanger?
Determina la secuencia del DNA molde conforme se sintetiza su hebra complementaria
No se degrada el DNA como en el método químico
Interrupción controlada de la síntesis de una hebra complementaria in vitro
La secuenciación de Sanger puede leer fragmentos de cuántos nt?
fragmentos de 50-300 nt
Qué hacen los ddNTPs (terminaodres) ?
— Carecen de OH en 3’ de la ribosa (DNA pol no puede añadir dNTPs)
— Provoca la terminación de la cadena aleatoriamente
— Marcados radioactivamente
Cuál es el proceso para el método Sanger?
- Desnaturalizar DNA molde por calor
- Hibridacion de primers específicos
- 4 dNTPs y ADN pol para amplificar el fragmento en 4 tubos
- 1 ddNTP distinto en cada tubo
- fragmentos de diferentes tamaños
6 Separar fragmentos por tamaño, electroforesis en gel de poliacrilamida - A partir del gel, se reconstruye la secuencia molde, que se lee de abajo para arriba (5’ a 3’)
manualmente
Características de la secuenciación automatizada
- Permite amplificar hasta 96 muestras en una sola corrida, pero en fragmentos de 30-60k
- 1 solo tubo
- Componentes: DNA pol, dNTPs, ddNTPs , Mg, primers
- Marcados con fluoroforos que emiten luz
- Se lee de abajo para arriba en una máquina
Cuál es la función de la NGS?
Permite secuenciar billones de fragmentos de ADN en multiples sitios y en escala masiva y
paralela (1 sola reacción)
Qué es la cobertura? para qué sirve?
promedio de número de lecturas alineadas a una sola
secuencia de referencia
— Qué tanto puedo abarcar mi fragmento de referencia
— Saber si está completa la lectura, si alcancé a cubrir todo el gen
Qué es la profundidad? para qué sirve?
número de repeticiones
(veces que ha sido secuenciado una base del genoma)
— Para ver qué tanto se va a reafirmar esta secuencia
Qué es la sensibilidad?
porcentaje de muestras positivas
Qué es el límite?
menor frecuencia de variante genética
Qué hace la especificidad?
detecta controles negativos
qué es la exactitud?
concordancia de mutaciones detectadas a las esperadas
qué es la precisión?
reproducibilidad de datos
Proceso de la NGS
- Fragmentación del DNA: mecánica (sonicacion) o enzimas de restricción
- Librerías
- Secuenciación: amplificación simultánea por PCR Ilumina o Ion Torrent
Cuáles son los tipos de secuenciación en NGS?
454 pirosecuenciación SOLID (por Roche)
Solexa (por Illumina)
PCR por emulsión Ion Torrent
Secuenciación de una sola molécula en tiempo real (la única que no es por hibridación)(SMRT)
Características de la pirosecuenciación?
- No emplea gel de acrilamida ni ddNTPs
- Secuencia fragmentos de 200-400 pb
- hibridación y liberación de pirofosfato
Proceso para la pirosecuenciación
- Se agrega la hebra de DNA a la gota de emulsión (polimerasa, dNTPs, etc.) con microesfera
- Se une la hebra de DNA a la microesfera y se replica
- Se rompe la gota de emulsión y se agrega la microesfera con DNA adherido al pocillo de la
placa - Se agregan ddNTPs por etapas
- Comienza la lectura de la liberación de pirofosfato
Qué tipo de secuenciación hace una amplificación “en puente” o cluster PCR?
Solexa
Características de la secuenciación de Solexa por Ilumina
- Amplificación “en puente” o cluster PCR
- Se cuenta con fragmentos de DNA adheridos directamente a celdas de flujo
- Placas tienen adaptadores que permiten que se una el DNA a la placa y genere copias
- Células de flujo con decenas de micropocillos
Características de secuenciación PCR por emulsión Ion torrent
Uso de un chip semiconductor con millones de pocillos que traducen la información química
(cambio del pH) a voltaje, y de voltaje a datos digitales (la secuencia de nt)
Proceso de Ion torrent
- DNA molde se fragmenta y los pedazos se unen a una microesfera
- Microesfera se deposita en un pocillo del chip
- Cada pocillo se llena de una solución con un dNTP distinto
- Fragmentos de DNA se complementan con los dNTPs y la union provoca la liberación de H+
- Solución del pocillo se acidifica
- Chip mide el ph y lo transforma en voltaje
