Secuenciación de proteínas y cristalografía Flashcards
Secuenciación de proteínas
- Se busca conocer la estructura primaria
- Ahora se puede determinar la secuencia de aminoácidos a partir del conocimiento de la secuencia del genoma
Científico que determinó la secuencia de aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de la insulina
Frederick Sanger
Análisis de péptidos
- La secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína está especificada genéticamente
- Se clona la secuencia de ácidos nucleicos que la codifican y se clona a su vez la proteína para su estudio pudiendo hacer cambios en la secuencia
Flujo de trabajo
- Extracción de proteínas (cuantificación (Bradford))
- Separación de las proteínas (cromatografía de exclusión molecular, de afinidad, de intercambio iónico)
- Procesamiento para secuenciación
Procesamiento de secuenciación
- Agentes reductores eliminan puentes disulfuro
- Alquilación de cisteínas evita la formación de puentes disulfuro otra vez
- Una hidrólisis completa permite determinar cuáles aminoácidos están presentes y en qué proporción
- Digestiones individuales con 2 diferentes agentes para obtener péptidos menores a 3KDa, purificación de fragmentos, su secuenciación y determinación de la secuencia global por traslape de los fragmentos individuales
De los reactivos usados para la fragmentación de cadenas polipeptídicas, ¿cuál es el único que NO es una proteasa?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar
d) Bromuro de cianógeno
¿Qué reactivos hacen la ruptura de la cadena polipeptídica en el grupo amino del aminoácido indicado?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar
c) Asp-N-proteasa
e) Pepsina
¿Qué reactivos hacen la ruptura de la cadena polipeptídica en el extremo carboxilo del aminoácido indicado?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
d) Bromuro de cianógeno
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar
¿Qué reactivo hace la ruptura de la cadena polipeptídica en el extremo carboxilo de los aminoácidos ácido aspártico y ácido glutámico?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
La Asp-N-proteasa hace lo mismo pero en el grupo amino de estos aminoácidos
¿Qué reactivo hace la ruptura de la cadena polipeptídica en más aminoácidos que cualquier otro reactivo?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar
e) Pepsina
Lo hace en 4: leucina, fenilalanina, triptófano y tirosina en sus grupos amino
¿Qué reactivo hace la ruptura de la cadena polipeptídica únicamente en el aminoácido metionina?
a) Endoproteinasa Lys-C
b) Tripsina
c) Asp-N-proteasa
d) Bromuro de cianógeno
e) Pepsina
f) Staphylococcus aureus V8 proteasa
g) Quimiotripsina
h) Proteasa submaxilar
d) Bromuro de cianógeno
¿Qué reacciones se usan para identificar el aminoácido amino-terminal?
- Sanger
- Edman
¿Cuáles son las espectrometrías de masas?
- MALDI (desorción/ionización láser asistida por matriz)
- ESI (ionización por electroespray)
- MS/MS (espectrometría de masas en tándem)
¿Cuál es el nombre del reactivo de Sanger?
2,4-dinitro-fluoro-fenilo
¿Qué tipo de reacción en la secuenciación de Sanger transforma el 2,4-dinitrofenil-péptido a 2,4-dinitrofenil del aminoácido N-terminal?
Hidrólisis ácida
¿Cuál es el nombre del reactivo de Edman?
Fenilisotiocianato
Degradación de Edman
- Al final se obtiene feniltiohidantoína del aminoácido N-terminal y queda el resto del péptido intacto
- Se realiza gracias a una hidrólisis con un pH bajo
- El aminoácido acortado e intacto vuelve a pasar por la reacción de Edman para determinar al nuevo aminoácido N-terminal
- Empleada en secuenciadores automáticos que sólo pueden secuenciar los primeros 40 aminoácidos del extremo N-terminal ya que el rendimiento de la reacción no es del 100% y se pierde parte del péptido poco a poco
- Se puede hidrolizar la proteína original y realizar la secuenciación de cada fragmento por separado
Huella digital de la proteína
- La secuencia de una proteína es única, por lo que al ser cortada origina un patrón peptídico específico
- Los valores exactos del conjunto de masas moleculares de los péptidos es la representación única de la estructura primaria de una determinada proteína
Espectro de masas
- Es información bidimensional que representa la abundancia de los diferentes tipos de iones en función a la relación masa/carga de cada uno de ellos
- Evidencia la relación masa/carga de los péptidos y se convierte en una huella digital de la proteína
¿Qué pasaría si en la muestra inicial analizada estaba constituida por una mezcla de diferentes proteínas?
La búsqueda en las bases de datos de los patrones representativos de los diferentes péptidos permitiría identificar cuales serían esas proteína que conforman esa mezcla
¿En qué consiste la espectrometría de masas?
- Ionización de los componentes de la muestra en fase gasesosa
- Separación de los iones resultantes de acuerdo a su relación masa/carga eléctrica, usando campos electromagnéticos en el vacío
- Permite deducir la masa de la molécula
¿Por qué la relación masa/carga no se podía aplicar para macromoléculas?
Porque el calentamiento para transitar a fase gasesosa las descomponía, pero en 1988 se desarrollaron 2 sistemas de ionización para solucionar esto
¿Cuáles son los 3 componentes del espectrómetro y sus funciones?
- Sistema de ionización: vaporización e ionización a partir de moléculas neutras
- Analizador de masas: separación de los iones en función de su relación masa/carga eléctrica
- Detector de iones: detección de iones formados
Sistema de ionización MALDI
- Muestras en fase sólida
1. Irradiación de un láser hacia un matriz con el polipéptido
2. Desorción (hay adsorción pero no se descompone
3. Desolvatación e ionización
