Inmunotécnicas Flashcards
¿Cuál de las siguientes inmunotécnicas se basan en la microscopía?
a) Western Blot
b) ELISA
c) Confocal de flourescencia
d) Inmunofluorescencia
e) Proteína de fusión con una etqieuta de epítropo
f) Citometría de flujo
g) Inmunohistoquímica
c) Confocal de flourescencia
d) Inmunofluorescencia
g) Inmunohistoquímica
¿Qué es un antígeno?
- Es una molécula que induce la formación de al menos un anticuerpo específico
- Tiene 1 o más epítopes
¿Qué es un epítope?
- Es una región de la molécula del antígeno que es reconocida por el anticuerpo, formada por aminoácidos
- Puede ser secuencial o conformacional
¿Qué es un anticuerpo?
- Es una proteína sérica conocida como inmunoglobulina que reconoce específicamente a un epítope del antígeno
- Su región constante (Fc) es específica de cada especie
- Monoclonal: producido por un solo clon de linfocitos B
- Policlonales: mezcla heterogénea de anticuerpos producidos por diferentes clones de linfocitos B
Inmunohistoquímica
- Identifica y localiza antígenos en una muestra de tejido
- Directo: anticuerpo primario específico para el antígeno que se trata de identificar, acoplado a una enzima
- Indirecto: anticuerpo primario de una especie en contra del antígeno que se trata de identificar o anticuerpo secundario, contra la Fc de la especie donde se obtuvo el anticuerpo primario, acoplado a una enzima
Metodología del inmunohistoquímica
- Fijación: inmoviliza y preserva las células, al unir covalentemente las moléculas proteicas a sus vecinas
- Cortes finos por un micrótomo
-Incubación con anticuerpos ya sea por el método directo o indirecto - Sistema de detección o visualización
- Cromógeno para la enzima
- Montaje
Nombre de los 2 antígenos del virus de la hepatitis B cuya presencia en sangre indica la replicación activa del virus
HBcAg y HBsAg
Nombre de la proteína secretora del virus de la hepatitis B que se procesa de la proteína precore
HBeAg
Microscopio de fluorescencia
Detecta específicamente algunas proteínas u otras moléculas en células y tejidos
¿Qué es el fluorocromo?
Es una molécula fluorescente de la que una parte de ella (fluoróforo) absorbe la luz de una determinada longitud de onda y emite luz de otra longitud de onda más larga
Método directo de la inmunofluorescencia
El anticuerpo primario específico para el antígeno que se trata de identificar, acoplado a un fluorocromo
Método indirecto de la inmunofluorescencia
- El anticuerpo primario de una especie en contra del antígeno que se trata de identificar
- El anticuerpo secundario acoplado a un fluorocromo
- El anticuerpo secundario reconoce específicamente la Fc de la especie donde se obtuvo el anticuerpo primario
Colocalización
Superposición espacial entre 2 etiquetas fluorescentes diferentes
Contratinción
Visualización de diferentes moléculas al mismo tiempo en una preparación
3 partes más importantes de un microscopio de fluorescencia
- Filtro de excitación
- Espejo dicroico
- Filtro de emisión
Filtro de excitación del microscopio de fluorescencia
Deja pasar solamente la luz de cierta longitud de onda
Espejo dicroico del microscopio de fluorescencia
Refleja la luz de cierta longitud de onda y transmite la luz de otra longitud de onda mayor
Filtro de emisión del microscopio de fluorescencia
Deja pasar la señal fluorescente de cierta longitud de onda específica
Nucleótido sintético, análogo a la timidina, que identifica las regiones en proceso de síntesis activa de ADN
BrdU o bromodesoxiuridina
Enzima y antígeno que colocalizan en regiones de síntesis activa de ADN
ADN polimerasa y PCNA (antígeno nuclear de proliferación nuclear)
Microscopio confocal de fluorescencia
- Permite obtener una imagen de la arquitectura tridimensional de una célula o tejido
- Usa métodos electrónicos que permite enfocar un plano de una muestra eliminando la luz que proviene de las zonas fuera de foco superiores o inferiores a ese plano
- Resulta fácil gracias a una serie de secciones ópticas obtenidas a diferentes profundidades
Citometría de flujo
- Se emplea en el recuento y clasificación de células según su morfología (tamaño y granularidad) y por la presencia de biomarcadores (marcados mediante anticuerpos acoplados a fluorocromos)
- Se puede detectar cualquier molécula en la célula, en tanto se tenga un anticuerpo específico para ella, acoplado a un fluorocromo
- Las células pueden contarse, separarse y recuperadas
ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima)
Permite evaluar a una proteína de manera cuantitativa
- Directo
- Indirecto
- Tipo sandwich
Western Blot
- Permite la detección mediante un anticuerpo específico, de una proteína dentro de una muestra biológica
- Estima el tamaño de la proteína por corrimiento electroforético
- Evidencia isoformas (podrían ser reconocidas por el mismo anticuerpo pero variarán en peso molecular)
- Compara los niveles de proteína entre muestras
¿Qué son las isoformas?
Son variantes alélicas que generan distintas formas de la misma proteína, splicing alternativo o maduración diferencial
Pasos del Western Blot
- Electroforesis
- Transferencia (electrotransferencia y difusión simple o pasiva)
- Inmunodetección
Proteína de fusión con una etiqueta de epítopo
- La proteína blanco está inalterada y se asume qu conserva su función y localización normal
- La etiqueta es una secuencia proteica corta que es reconocida fuertemente por un anticuerpo bien comercializado
- Se puede emplear para inmunofluorescencia e inmunoprecipitación
Inmunoprecipitación
- Permite identificar interacciones funcionales proteína-proteína con proteínas hasta ese momento desconocidas
- El complejo proteico puede estar formado por varias proteínas que serán estudiadas
- Una variante pueder ser la purificación del complejo proteico por columna de afinidad, inmovilizando el anticuerpo en la columna
