Purificación de proteínas Flashcards
Purificación de una nueva proteína
- Se emplean diferentes métodos secuenciales de forma empírica hasta encontrar la mejor forma
- Con cada paso, la cantidad de muestra se hace más pequeña pero la actividad específica va siendo mayor
- ## Los métodos caros se reservan para el final
Tipos de cromatografía
- En papel
- En capa fina
- En columna
- De intercambio iónico
- De exclusión molecular
- De afinidad
- Líquida de alto rendimiento
¿Qué es la cromatografía?
- Técnica para fraccionar mezclas orgánicas al desplazarlas a través de una matriz
- Método de separación en el que se aprovechan las diferencias en el coeficiente de partición entre una fase móvil y una estacionaria para separar componentes de una mezcla
¿Qué es el coeficiente de partición?
Cociente entre las concentraciones de una sustancia en las 2 fases formadas por 2 disolventes inmiscibles en equilibrio, que mide la solubilidad diferencial de una sustancia en esos 2 disolventes
Fases de la cromatografía
- Un soporte mantienen sostenida la fase estacionaria
- En la fase estacionaria, los componentes de la muestra que interaccionan con ella, tendrán un tiempo de retención mayor
- La fase móvil acarrea la muestra
¿Qué es la retención?
Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser sólido o un líquido anclado a un soporte sólido
¿Qué es el desplazamiento?
Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil que puede ser un líquido o gas
¿Qué es la elución?
Migración (pero también separación) de los componentes de una mezcla retenidos en la fase estacionaria, impulsados por el desplazamiento ejercido por la fase móvil
Cromatografía sólido-líquido
Fase estacionaria: sólido
Fase móvil: líquido
Cromatografía líquido-líquido
Fase estacionaria: líquido anclado a un soporte sólido
Fase móvil: líquido
Cromatografía líquido-gas
Fase estacionaria: líquido no volátil impregnado en un sólido
Fase móvil: gas
Cromatografía sólido-gas
Fase estacionaria: sólido
Fase móvil: gas
Cromatografía en papel
- Fase estacionaria: papel filtro
- Para aminoácidos individuales o dipéptidos
- Empleada por Sanger en la secuenciación de insulina
Cromatografía en capa fina
- Fase estacionaria: placa adsorbente (sílica gel y alumina), adherida a un soporte de plástico, vidrio o aluminio
- Se pone en una solución alcóholica
Cromatografía en columna
- Fase estacionaria: se empaqueta en una columna, evitando que el aire quede atrapado interrumpiendo la continuidad de las fases
- La muestra se aplica en la parte superior de la columna y se eluye con una mezcla de solventes de diferentes polaridades, provocando que los componentes que se eluyen a diferentes velocidades podrán ser separados
Solventes de diferentes polaridades en la cromatografía en columna
Eluyente polar desplaza las moléculas más polares rápidamente, aunque no debe ser muy polar ya que habrá poca separación
Cromatografía de intercambio iónico
Aprovecha las diferencias en signo y magnitud de las cargas que tienen las moléculas como las proteínas a distintos pH
Mecanismo básico de la cromatografía de intercambio iónico
Intercambio reversible de iones en solución con los grupos funcionales cargados y unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina
Intercambio catiónico de la cromatografía de intercambio iónico
Resina carga negativa
- Fuerte: ácido sulfónico
- Débil: ácido carboxílico
Intercambio aniónico de la cromatografía de intercambio iónico
Resina carga positiva
- Fuerte: aminas cuarternarias
- Débil: aminas secundarias o terciarias
Cromatografía de intercambio aniónico
Una molécula de carga negativa se une a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al incrementar la concentración de sales
Intercambio iónico de péptidos
- La separación se optimiza cambiando gradualmente el pH o la concentración de sales de la fase móvil para crear una gradiente
- Las moléculas con carga opuesta a la de la matriz migrarán mas lento que aquellas con carga del mismo signo que la fase estacionaria
Cromatografía de exclusión molecular (filtración de gel)
- Fase estacionaria: material poroso inerte
- Separación del soluto según su tamaño y peso molecular
- Las moléculas pequeñas entran en los espacios dentro de la matriz y son retrasadas, mientras que las moléculas grandes pasan por fuera de la perla y atraviesan más libremente y rápidamente
Característica falsa sobre la cromatografía de exlcusión molecular
a) Su mecanismo se basa en el tamaño en disolución
b) Las moléculas de mayor peso molecular eluyen antes
c) Una proteína cilíndrica pasaría más rápido porque su tamaño es mayor
d) Las fases estacionarias pueden afectar al orden de elución debido a los cambios de tamaño en disolución
e) Todas son correctas
d) Las fases estacionarias pueden afectar al orden de elución debido a los cambios de tamaño en disolución
R =
Las fases móviles pueden afectar al orden de elución debido a los cambios de tamaño en disolución
Cromatografía de mayor especificidad y selectividad para la purificación de biomoléculas
Cromatografía de afinidad
Cromatografía de afinidad
Se basa en la interacción específica de 2 moléculas
- Antígeno/anticuerpo
- Enzima/sustrato
- Receptor/ligando
- Una de ellas se une covalentemente a la fase estacionaria
Condiciones que provocarían que un cambio del medio eluyente liberara a las moléculas retenidas en la fase estacionaria en una cromatografía de afinidad
- pH (afecta al estado de ionización de las biomoléculas)
- Fuerza iónica (concentración de sales)
- Polaridad (solubilidad)
- Solución de las moléculas inmovilizadas
Etiquetas terminales (purificación por afinidad)
- Se expresa una proteína recombinante de fusión con un péptido (etiqueta) que une con alta afinidad y especificidad a un ligando
- La etiqueta se remueve con una proteasa que corta cerca de la unión entre la proteína de interés y la etiqueta
Cromatografía líquida de alto rendimiento
- Líquido-líquido
- Uso de bombas de alta presión para mover moléculas a través de la columna
- Ideal para componentes no volátiles, azúcares, vitaminas, drogas, etc…
- Se pueden realizar curvas de calibración con estándares de composición y concentración
Cromatografía líquida de alto rendimiento
- Líquido-líquido
- Uso de bombas de alta presión para mover moléculas a través de la columna
- Ideal para componentes no volátiles, azúcares, vitaminas, drogas, etc…
- Se pueden realizar curvas de calibración con estándares de composición y concentración
Tipos de electroforesis en gel
- 1 dimensión (PAGE)
- 2 dimensiones (2D)
¿Qué es electroforesis?
Herramienta usada para aislar y purificar macromoléculas en base a su movilidad dentro de un soporte sólido en un campo eléctrico
Geles de poliacrilamida
Análisis de proteínas y ácidos nucleicos
Geles de agarosa
Análisis de ácidos nucleicos
¿A partir de qué número de pares de bases ya no es posible diferenciar los elementos en una electroforesis con gel de agarosa?
Menos de 20 pb
Movilidad electroforética
- La movilidad de la molécula depende de su peso molecular y su carga eléctrica
- Las diferentes movilidades exhiben las diferentes macromoléculas las que permiten su separación
Electrodo al que se mueven los cationes en una electroforesis
a) Cátodo
b) Ánodo
a) Cátodo
Electrodo al que se mueven los cationes en una electroforesis
a) Cátodo
b) Ánodo
b) Ánodo
Factores intrínsecos de la molécula en una electroforesis
- Carga eléctrica (grupos funcionales)
- Peso molecular (átomos que lo conforman)
Factores intrínsecos de la molécula en una electroforesis
- Concentración del gel
- Voltaje aplicado
- Tiempo de corrida
- Temperatura
Factores extrínsecos de la molécula en una electroforesis
- Concentración del gel
- Voltaje aplicado
- Tiempo de corrida
- Temperatura
Características falsas sobre la movilidad electroforética
a) Los factores intrínsecos en una electroforesis NO se pueden modificar
b) La carga eléctrica en los ácidos nucleicos están en las bases nitrogenadas
c) Si aumenta el peso molecular, disminuye la carga eléctrica en una electroforesis
d) La relación carga eléctrica/peso molecular de las proteínas es constante
e) La relación carga eléctrica/peso molecular de los ácidos nucleicos no es constante
f) A mayor relación carga eléctrica/peso molecular, mayor movilidad
g) Si la relación carga eléctrica/peso molecular es constante, la movilidad queda en función de la carga eléctrica
b) La carga eléctrica en los ácidos nucleicos están en las bases nitrogenadas
c) Si aumenta el peso molecular, disminuye la carga eléctrica en una electroforesis
d) La relación carga eléctrica/peso molecular de las proteínas es constante
e) La relación carga eléctrica/peso molecular de los ácidos nucleicos no es constante
g) Si la relación carga eléctrica/peso molecular es constante, la movilidad queda en función de la carga eléctrica
R =
La carga eléctrica en los ácidos nucleicos están en los grupos fosfato
Si aumenta el peso molecular, aumenta la carga eléctrica en una electroforesis
La relación carga eléctrica/peso molecular de las proteínas NO es constante
La relación carga eléctrica/peso molecular de los ácidos nucleicos es constante
Si la relación carga eléctrica/peso molecular es constante, la movilidad queda en función del peso molecular
