Secuenciación de ADN

Question 1

Secuenciación de ADN

Answer 1

• Ocurrió por la introducción de métodos electroforéticos y por el conocimiento de nucleótidos y metabolismo de ADN
• Se busca 4 juegos de fragmentos marcados, que c/u corresponde a una de las 4 bases
• Primero se empleó la marca radioactiva y luego la fluorescencia

Question 2

Métodos de secuenciación de ADN

Answer 2

Método químico
- Maxam y Gilbert
Métodos enzimáticos
- Sanger
- Automatizada
Siguiente generación
- 454-pirosecuenciación
- Ilumina
Secuenciación por bisulfito

Question 3

3 etapas del método de Maxam y Gilbert

Answer 3

1. Marcaje del ADN
2. Hidrólisis química específica del ADN
3. Análisis de los productos

Question 4

Maxam y Gilbert. Marcaje del ADN

Answer 4

• Marca el extremo 5’ de c/hebra
• Se usa polinucleótido cinasa y ATP radioactivo

Question 5

Maxam y Gilbert. Hidrólisis química específica del ADN

Answer 5

• Se obtienen fragmentos de ADN de hebra sencilla, marcados y que terminen en un nucleótido conocido
• La muestra se divide en 4 alícuotas y c/u recibe tx. químico diferente, para eliminar separadamente las bases púricas y pirimidínicas

Question 6

Maxam y Gilbert. Análisis de los productos

Answer 6

Mezclas obtenidas analizadas por electroforesis

Question 7

Método de Sanger

Answer 7

• Se basa en la replicación del ADN
• La polimerización ocurre solo en la dirección 3’; la polmerasa carece de actividad 3’-5’ exonucleasa de corrección
• Se usan 2’,3’ didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) y 2’-desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)
• Se generan fragmentos de diferentes longitudes por la interrupcion de la polimerización cada que un ddNTP se una a la cadena creciente

Question 8

Secuenciación automatizada

Answer 8

• Variación del método de Sanger pero con ddNTPs marcados con fluorescencia en vez de radiación
• Todo ocurre en un solo tubo ya que se puede distinguir entre ellos
• Separación de fragmentos de ADN se logra por electroforesis capilar detectando diferencias en longitud de un solo nucleótido
• Los fragmentos cortos están hacia el 5’ y los largos hacia la dirección 3’

Question 9

Electroferograma

Answer 9

Gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis

Question 10

Característica falsa sobre la 454-pirosecuenciación
a) La 454-pirosecuenciación permite secuenciar la mitad de un genoma humano en 2 días
b) En la 454-pirosecuenciación no se requiere correr los fragmentos en un gel, ni marcadores fluorescentes o ddNTPs
c) El método de secuenciación de la 454-pirosecuenciación está basado en la liberación de pirofosfatos en la reacción de polimerización
d) Fragmenta el genoma en fragmentos de 300 - 800 pb

Answer 10

a) La 454-pirosecuenciación permite secuenciar la mitad de un genoma humano en 2 días

R =
La 454-pirosecuenciación permite secuenciar el genoma humano en un día

Question 10

Característica falsa sobre la 454-pirosecuenciación
a) La 454-pirosecuenciación permite secuenciar la mitad de un genoma humano en 2 días
b) En la 454-pirosecuenciación no se requiere correr los fragmentos en un gel, ni marcadores fluorescentes o ddNTPs
c) El método de secuenciación de la 454-pirosecuenciación está basado en la liberación de pirofosfatos en la reacción de polimerización
d) Fragmenta el genoma en fragmentos de 300 - 800 pb

Answer 10

a) La 454-pirosecuenciación permite secuenciar la mitad de un genoma humano en 2 días

R =
La 454-pirosecuenciación permite secuenciar el genoma humano en un día