Cultivo celular Flashcards
Cultivo celular
Conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células “in vitro”, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas
¿Qué es “in vitro”?
Técnica para realizar un determinado experimento en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo
Tipo de organismos que se cultivan en un cultivo bacteriológico
- Microorganismos
- Bacterias, hongos y parásitos
Tipo de organismos que se cultiva en un cultivo celular
- Células eucariotas
- Protozoarios y levaduras (unicelulares)
- Células de un tejido celular
¿Qué es el ciclo de crecimiento microbiano?
- Es la curva que describe el ciclo entero de crecimiento
- Es el reflejo de eventos poblacionales de células individuales
Fase de latencia
- Tiempo que tarda en empezar el crecimiento de un microorganismo tras ser inoculado en medio fresco
- Depende de la historia del inoculo, naturaleza del medio y condiciones de crecimiento
Posibles escenarios de la fase de latencia
- Si un cultivo en fase exponencial se transfiere a medio fresco bajo las mismas condiciones de crecimiento, no habrá fase de latencia y prosigue la fase exponencial
- Si el inoculo proviene de un cultivo viejo, las células están depletas de constituyentes esenciales para el crecimiento, se tomará tiempo volver a sintetizarlos
- Si el medio cambia y se disponen de otros sustratos, se requerirá sintetizar enzimas que permitirán aprovecharlos, lo cual lleva tiempo
Fase exponencial
- Estado más saludable de las células
- Es ideal para estudio de enzimas u otros componentes celulares
- Se duplican el número de celulas en intervalos de tiempo constantes
- En un tubo cerrado, los organismos NO crecen indefinidamente de forma
¿Cuántas generaciones puede un cultivo permanecer en fase exponencial?
Menos de 10 generaciones
Peso de una bacteria
1 x 10^-15 kg
Fase estacionaria
- Comienza por agotamiento de nutrientes o acumulación de desechos
- El crecimiento se mantiene constante, es decir algunas crecen mientras otras mueren
Fase de muerte
- También es exponencial, pero es más lenta que la exponencial de crecimiento; su pendiente es menos pronunciada que la fase exponencial
- Las células pueden permanecer viables durante meses o incluso años
Monitoreo del rendimiento de cultivos por espectrofotometría
- Las células dispersan la luz
- La turbidez de una suspensión celular aumenta en la medida en que hay más células presentes
- Se mide la luz que atraviesa la suspensión sin ser dispersada
Espectrofotometría en 2 organismos de tipos celulares
- Pueden tener densidades ópticas diferentes a tiempos similares de medición por diferencias en tamaños y formas o en velocidades de crecimiento
- Cuando la turbidez es excesiva se pierde la correspondencia entre el número de células y la densidad óptica porque la luz dispersada de la fotocelda por una célula puede ser nuevamente enviada a la fotocelda por otra célula
¿Gracias a qué elementos se puede llevar a cabo el desarrollo de un cultivo celular?
- Medios de cultivo
- Antibióticos
- Instalaciones sépticas (salas, cabinas de flujo laminar, incubadoras)
- Dispositivos de cultivo (frascos T, cajas Petri)
Filtro de la cabina de flujo laminar que filtra el aire estéril y no da paso a bacterias
Filtro EPA
Medios de cultivo (en general)
- pH de 7.4
- Los indicadores de pH (rojo fenol), cambian de color a medida que aparecen catabolitos ácidos como resultado del metabolismo celular
- Tiene antibióticos y antimicóticos para impedir contaminación
Medios de cultivo con suero
Mezcla poco definida de macromoléculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo
Medios de cultivo libres de suero
Químicamente definidos con moléculas necesarias para la supervivencia y proliferación como factores de crecimiento
Condiciones de cultivo celular
- Incubación a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2, 95% aire
¿Qué es un frasco T?
Recipiente típico de 175 cm² puede contener 1x10^7 células adheridas, y unas 1x10^8 células cuando se trata de líneas que crecen en suspensión
- Tiene un filtro que permite el intercambio gaseoso
Tipos de cultivo
- Primarios
- Secundarios
- Líneas celulares
- Hibridomas
Tipos de cultivos primarios
- Monocapa
- Suspensión
Se puede saber cuantas células hay porque son adherentes pero necesitan de un sustrato
Cultivos primarios
- Se preparan directamente a partir de un tejido u órgano
- Con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares
- Células conservan sus características originales y su proliferación es limitada
- Pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios
Cultivo primario monocapa
- Requieren de una superficie sólida sobre la cual crecer y multiplicarse
- Son anclaje dependientes (al sustrato) y NO están unas sobre otras
- NO aplican las hematopoyéticas maduras
- Su soporte es la base de un placa o frasco de plástico con residuos de matriz extracelular, el cual debe de recubrirse con colágeno y laminina
- Hay confluencia porque el área de anclaje está cubierta de células
Cultivo primario en suspensión
- Células dispersas en el medio de cultivo
- Alcanzan confluencia cuando el número de células es grande y los nutrientes insuficientes
- Células bacterianas
Cultivos secundarios
- Células en monocapa confluente detienen su crecimiento debido a la inhibición por contacto, a menos que se subcultiven a un recipiente con medio fresco
- Células muestran propiedades diferentes según su origen
Ejemplos de propiedades diferentes de las células en cultivos secundarios
- Fibroblastos: secretan colágeno
- Células de tejido muscular esquelético: se fusionan para generar fibras musculares con capacidad contráctil espontánea
- Células nerviosas: extienden sus axones eléctricos para establecer sinapsis con otras células
Líneas celulares
- Son células inmortales y malignas
- Crecimiento aberrante (sin inhibición por contacto ni anclaje dependientes)
- Genéticamente inestables
- No todas las células humanas se transforman así
- Se relacionan con los oncogenes (genes promotores de cáncer) obtenidos de virus
¿Qué gen puede inmortalizar a los fibroblastos normales?
Gen que codifica para la telomerasa
¿Las células de qué clase de animales experimentan cambios genéticos espontáneos que las inmortalizan cuando se cultivan?
De roedores
Nombre de la primera línea celular humana
HeLa (1952) para adenocarcinoma cervical
¿A partir de qué semana se puede empezar la fase muerte o fase de transfomación (inmortalidad) en un cultivo celular?
Semana 14
¿A partir de qué semana se puede empezar la fase muerte o fase de transfomación (inmortalidad) en un cultivo celular?
Semana 14
Ventajas de cultivo celular
- Condiciones controladas
- Representan tipos celulares específicos
- Acreditación de su pureza
- Reproduciblidad experimental
- Consumo reducido de reactivos
- Útiles en las primeras etapas de investigación
- Evita el uso de animales
- Se pueden almacenar en nitrógeno líquido (-196°C)
Desventajas de cultivo celular
- Experiencia para evitar contaminación y mala identificación
- Espacio de trabajo
- Equipos especializados
- Manejo de desechos plásticos y biológicos peligrosos
- Inestabilidad genética
- Pérdida de diferenciación
Hibridomas
- Producción de anticuerpos monoclonales
- Hay fusión de linfocitos B secretores de inmunoglobulinas (anticuerpos) y células derivadas de una línea tumoral de linfocitos B
¿Qué es un heterocarionte?
Célula con núcleos genéticamente diferentes separados pero con contenidos citoplasmáticos compartidos
¿Qúe significan las siglas HAT?
Hipoxantina
Aminopterina
Timidina
¿Qué es la aminopterina?
Es el antagonista competitivo del ácido dihidrofólico, que es una vitamina necesaria en la síntesis de los nucleótidos
Vías alternas para la síntesis de ADN
Son tomadas por las células, pero son defectivas en la línea celular tumoral pero están intactas en las células del bazo, por lo que sólo las células híbridas sobreviven
Enzima que transforma en la hipoxantina en AMP o GMP en una de las vías alternas para la síntesis del ADN
Hipoxantina guanina fosforibosil transferasa
Enzima que transforma en la timidina en CMP o TMP en una de las vías alternas para la síntesis del ADN
Timidinoquinasa
¿Qué ocurre con un heterocarionte cuando entra en mitosis?
- Se produce una célula híbrida en la cual las envolturas de ambos núcleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un único núcleo
- Cada clon produce un anticuerpo monoclonal y prolifera indefinidamente
¿Qué reconoce un anticuerpo monoclonal?
Un único epítope antigénico
