PCR y sus variantes

Question 1

Función de la PCR

Answer 1

Puede amplificar selectivamente una secuencia deseada de ADN de una copia única que se encuentre presente en una mezcla compleja de moléculas de ADN sin purificación previa de la secuencia de interés

Question 2

Creador de la PCR

Answer 2

Kary Mullis (1993 Nobel de Química)

Question 3

Oligonucleótidos que logran que sólo se amplifique una zona del ADN en la PCR

Answer 3

Primers o cebadores

Question 4

Función de la ADN polimerasa termoestable

Answer 4

Sintetiza la hebra complementaria incorporando los desoxinucleótidos (dNTPs) libres del medio de reacción

Question 5

¿En qué consiste una PCR?

Answer 5

En ciclos controlados de temperaturas de desnaturalización, alineamiento y elongación

Question 6

Pasos de la PCR

Answer 6

• Desnaturalización
• Alineamiento
• Elongación

Question 7

Desnaturalización

Answer 7

Se usan temperaturas altas (94 - 95°C) para romper los puentes de hidrógeno y evitar la renaturalización del ADN

Question 8

¿Qué es relevante de los primers en el 1° ciclo?

Answer 8

• Alineación: al disminuir la temperatura, los primers hibridan específicamente en los extremos de la secuencia blanco; hay un primer en cada hebra
• Elongación: dirigen a la ADN polimerasa que sintetiza la hebra complementaria

Question 9

Temperatura a la que normalmente se da la alineación y la elongación

Answer 9

Alineación: 55°C
Elongación: 72°C

Question 10

¿Qué ocurre al final del 1° ciclo de una PCR?

Answer 10

Se tienen 2 moléculas de ADN doble cadena parcial que contienen la secuencia blanco, pero sólo el ADN que contiene la secuencia blanco es copiado ya que la polimerasa solo puede copiar moléculas que tienen el cebador unido

Question 11

¿Qué ocurre al final del 2° ciclo?

Answer 11

Se tienen 4 moléculas de ADN doble cadena parcial que contienen la secuencia blanco

Question 12

¿Qué ocurre al final del 3° ciclo?

Answer 12

Se tienen 8 moléculas de ADN doble cadena parcial que contienen la secuencia blanco

Question 13

¿Qué ocurre al final del 4° ciclo?

Answer 13

Se tienen 16 moléculas de ADN doble cadena parcial que contienen la secuencia blanco

Question 14

¿Qué ocurre al final del 5° ciclo?

Answer 14

Se tienen 32 moléculas de ADN doble cadena parcial que contienen la secuencia blanco

Question 14

¿Qué ocurre al final del 30° ciclo?

Answer 14

Hay más de 1x10^9 moléculas de producto específico y solamente 60 moléculas parcialmente doble cadena más largas

Question 14

¿Qué es un termociclador?

Answer 14

Es una máquina de PCR que tiene la capacidad de mantener los cmabios de temperatura cíclicos de forma precisa

Question 15

¿Cuáles son las 3 fases de una PCR?

Answer 15

• Exponencial (detecta PCR de tiempo real)
• Lineal
• Meseta (detecta PCR convencional)

Question 16

Característica falsa sobre la PCR
a) Un mayor número de copias de ADN molde dan una banda más intensa del amplificado
b) A mayor número de ciclos, mayor cantidad de producto de PCR
c) El tamaño del amplificado espeçifico que se espera de la reacción se conoce exactamente porque se conoce la secuencia exacta y número de pares de bases que los primers están flanqueando
d) Todas son verdaderas

Answer 16

d) Todas son verdaderas

Question 17

Fase en la que los componentes de la reacción se agotan y la amplificación se detiene

Answer 17

Fase plateau

Question 18

PCR con adaptadores

Answer 18

• Amplifica región de ADN con secuencia desconocida
• ## Unión de adaptadores a los fragmentos de restricción de extremos cohesivos

Question 19

PCR inversa

Answer 19

Amplifica secuencias desconocidas con la condición de que se encuentran al lado de una secuencia conocida de ADN

Question 20

Mutagénesis dirigida

Answer 20

• Variedad de técnicas in vitro que modifican la secuencia silvestre
• Se emplea cuando no hay sitios de restricción localizados en el lugar deseado
• Se pueden cambiar 1 o 3 bases en un segmento de ADN determinado sintetizando primers de PCR que lleven estos cambios

Question 21

Procedimiento de RT - PCR

Answer 21

• Uso de 2 polimerasas
• ADN polimerasa ARN dependiente sintetiza cADN a partir de ARNm
• Los clones de cADN contienen secuencias codificantes discontinuas
• cADN se amplifica por PCR por la ADN polimerasa ADN dependiente

Question 22

Datos de la PCR Tiempo Real

Answer 22

• PCR cuantitativa
• Amplifica y cuantifica el producto específico de la amplificación
• Se adiciona un fluoróforo a la mezcla de reacción, emitiendo fluorescencia de acuerdo a la abundacia del producto de amplificación
• La medida de fluorescencia se realiza cada ciclo de amplificación

Question 23

Ct (cycle threshold)

Answer 23

• No. de ciclos requeridos para que la fluorescencia específica sobrepase la fluorescencia de fondo inespecífica
• Inversamente proporcional a la cantidad de ADN blanco inicial

Question 24

Se usan como fluoróforos en la RT-PCR

Answer 24

• SYBR Green
• Sondas TaqMan

Question 25

SYBR Green

Answer 25

• Interactua con la hendidura menor del ADN doble cadena
• Pico de absorción = 498 nm
• Pico de emisión = 522 nm

Question 26

Sondas TaqMan

Answer 26

• Se basa en la actividad 5’ - 3’ exonucleasa de la polimerasa, la cual degrada la sonda hibridada con los primers
• La fluorescencia se mide durante la fase exponencial
• Aumenta la especificidad de la detección

Question 27

Quencher

Answer 27

Fluoróforo que absorbe longitud de onda y emite otra que no detecta el equipo

Question 28

RT -qPCR

Answer 28

• La 1° reacción de retrotranscripción la lleva a cabo la ADN polimerasa ARN dependiente
• Se amplifica el cADN por PCR cuantitativa
• Niveles de expresión de un gen en particular se normalizan con respecto al nivel de expresión de un gen constitutivo para hacer comparaciones

Question 29

PCR múltiplex

Answer 29

• Se amplifica más de una secuencia en una misma reacción
• Emplea 2 o más pares de primers para que se amplifiquen simultáneamente múltiples segmentos de ADN, y deben tener un producto de amplificación diferente para distinguirlos