Extracción, cuantificación y purificación de ácidos nucleicos Flashcards
¿Cuál es primer paso en la tecnología del ADN recombinante?
El aislamiento del ADN
¿Cuáles serían las aplicaciones o usos del aislamiento del ADN?
- Amplificación (mediante PCR)
- Secuenciación
- Determinación de polimorfismos
- Diagnóstico de enfermedades
- Transferencia génica (para OMG, agricultura y farmaceútica)
- Obtención de proteínas recombinantes
- Terapia génica
¿Qué significa OMG?
Organismos Modificados Genéticamente
Características del ADN de células eucariotas
- El ADN genómico está en el núcleo
- Asociado a proteínas
- ADN mitocondrial
- Protegido por compartimientos delimitados y rodeados por membranas
Tipo de ADN presente en procariotas principalmente, aunque también puede exisitir en las mitocondrias y cloroplastas de levaduras eucariotas
ADN plasmídico
Pasos de la extracción de ADN genómico
1- Muestra de células
2. Añadir buffer de lisis para mantener el pH, romper las membranas, desnaturalizar y degradar proteínas
3. Precipitación de proteínas
4. Precipitación del ADN con alcohol frío y alta concentración de sal
5. Lavados
6. Resuspensión en agua libre de nucleasas
7. Cuantificación y determinación de la pureza
¿Qué es la centrifugación de gradiente de densidad o Ficoll-Paque?
Es el método más común para separar los PBMC (células mononucleares de sangre periférica) de los glóbulos rojos (RBC y células polimorfonucleares)
¿Qué leucocitos son conocido en conjunto como granulocitos (polimorfonucleares)?
- Neutrófilos
- Eosinófilos
- Basófilos
¿Qué leucocitos son conocido en conjunto como agranulocitos (mononucleares)?
- Monocitos
- Linfocitos
¿Cuál es el orden, del menos denso al más denso, de los componentes de la sangre y del ficol, si se coloca sangre periférica en un frasco con ficol?
- Plasma
- Células mononucleares
- Ficoll
- Granulocitos
- Eritrocitos o RBCs
3 componentes del buffer de lisis
- 50 mM de Tris-HCl (clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano)
- 1% de SDS (dodecil sulfato de sodio)
- 2 mg/ml de alguna proteasa (proteinasa K)
¿Cuál es el pH de Tris-HCl (clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano)?
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¿Qué es el Tris-HCl (clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano)?
Buffer para mantener el pH en el cual del ADN se mantiene estable y con carga negativa
¿Qué es el SDS (dodecil sulfato de sodio)?
Detergente aniónico para romper las membranas promoviendo la liberación de ADN; desnaturaliza las proteínas dejándolas accesibles para las proteasas
Características verdaderas de la proteinasa K
a) Es altamente activa sobre proteínas nativas y desnaturalizantes
b) Es una glicina proteasa
c) Activa e inactiva ARNasas y ADNasas
d) Destruye proteínas que crean un enlace con el ADN
e) Incrementa la pureza del ADN al reducir la contaminación por parte de las proteínas
f) Disminuye la calidad y cantidad de ADN no degradado
a) Es altamente activa sobre proteínas nativas y desnaturalizantes
d) Destruye proteínas que crean un enlace con el ADN
e) Incrementa la pureza del ADN al reducir la contaminación por parte de las proteínas
R =
Es una serina proteasa
Únicamente inactiva ARNasas y ADNasas
Aumenta la calidad y cantidad de ADN no degradado
Precipitación de proteínas
- Las proteínas se insolubilizan y precipitan
- Se pueden centrifugar, quedando con el precipitado, junto con los restos celulares
- En el sobrenadante se encuentra el ácido nucleico
- Usualmente se emplean las soluciones de acetona
Precipitación del ADN
- Se requiere una alta concentración de sales (NaCl)
- Los iones Na+ neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato
- Las moléculas de ADN se juntan en lugar de repelerse una a la otra
- Se disminuye la solubilidad del ADN en el ambiente acuoso, facilitando su precipitación al añadir el alcohol
¿Qué es el etanol?
- Molécula menos polar que el agua, que justamente es miscible con ella
- El ADN no es soluble en el, por lo que al agregarse la solución de ácidos nucleicos provoca que el ADN precipita
Características verdaderas sobre la precipitación del ADN
a) El ADN es más polar que el ARN
b) Al disminuir la temperatura, el ADN se insolubiliza aun más
c) Si se le agrega etanol al ARN, el ARN precipitaría
d) Las moléculas de ADN insolubilizado semejan a hilos blancos de una telaraña
e) Al final se obtiene una pastilla blanca y compacta en el fondo del tubo
f) Todas son correctas
b) Al disminuir la temperatura, el ADN se insolubiliza aun más
d) Las moléculas de ADN insolubilizado semejan a hilos blancos de una telaraña
e) Al final se obtiene una pastilla blanca y compacta en el fondo del tubo
R =
El ARN es más polar que el ADN
Si se le agrega etanol al ARN, el ARN no precipitaría
Lavados
Se lavan con soluciones de etanol al 75%, lo cual remueve las sales y otras impurezas sin disolver el ADN
Resuspensión del ADN
Se insolubiliza en agua libre de nucleasas
Valor de la absorbancia a la que se ajusta el espectrofotómetro para calcular la concentración de ácidos nucleicos
260 nm
¿Cuánto vale el coeficiente que determina la pureza de los ácidos nucleicos?
260/280
Valores, basados en el coeficiente de pureza, para calificar una extracción de ADN
Óptima: 1.8 - 2
Aceptable: 1.6 - 1.8
Contaminación con compuestos aromáticos y proteínas: <1.6
Contaminación con ARN: >2.1
Método más usado para la extracción de ARN
Método del fenol-cloroformo
Pasos del método fenol-cloroformo
- Rompe membranas, desnaturaliza proteínas y libera ácidos nucleicos de moléculas asociadas
- La adición de más cloroformo separa las fases
- Se retira la fase acuosa y en otro tubo se le adiciona alcohol (lisopropanol) frío, el cual es menos polar que el etanol
- Centrifugar
- Lavar el pellet con etanol al 75%
- Resuspender el ARN
- Aplicar el coeficiente de pureza 260/280
Valores, basados en el coeficiente de pureza, para calificar una extracción de ARN
Óptima: 2 - 2.2
Aceptable: >1.7
Contaminación con compuestos aromáticos y proteínas: <1.7
¿Cuáles son los 2 mecanismos para la purificación del ADN luego de pasar por la cuantificación y determinación de la pureza?
- Cromatografía de afinidad
- Electroforesis
¿Cuál es el medio de soporte sólido de una electroforesis?
Gel de poliacrilamida o de agarosa
Gel de poliacrilamida
Se usa para análisis de muestras de proteínas y ácidos nucleicos, pero únicamente cuando se requiera mayor resolución que la puede brindar la agarosa
Gel de agarosa
Se usa para análisis de muestras de ácidos nucleicos, aunque no pueden observarse diferencias menores a 20 pb en pesos moleculares de las moléculas analizadas
Factores intrínsecos a la partícula en una electroforesis
- Relación carga/masa
- Peso molecular
Factores extrínsecos a la partícula en una electroforesis
- Concentración de agarosa
- Voltaje aplicado
- Tiempo de corrida
- Temperatura
¿Qué es la agarosa?
- Polisacárido formado por β-(1-4)-(3-6)-anhidro-L-galactosa y α-(1-3)-D-galactosa
- Soluble en agua a temperaturas superiores a 65°C
- Se disuelve y se pone en la cámara de electroforesis
- Da forma de matriz inerte y no tóxica
Concentración de agarosa en gel para electroforesis
0.5 - 4% (peso/volumen)
¿Cuál es el enunciado correcto respecto a la movilidad en base a la concentración de agarosa?
a) La movilidad aumenta al aumentar el porcentaje de agarosa
b) Entre mayor concentración de agarosa, hay menor movilidad aunque su permeabilidad es mejor
c) Si la concentración de agarosa es muy alta, se tendrá mejor resolución
d) Todas son correctos
b) Entre mayor concentración de agarosa, hay menor movilidad aunque su permeabilidad es mejor
R =
La movilidad disminuye al aumentar el porcentaje de agarosa
Si la concentración de agarosa es muy alta, se tendrá menor resolución
Voltaje típico aplicado en una electroforesis
10 V/cm de gel
- En geles de 10 - 15 cm = 100 V - 130 V
¿Cuál es el enunciado correcto respecto al voltaje aplicado en una electroforesis?
a) Al incrementar el voltaje, la movilidad aumenta pero no necesariamente la resolución
b) Hay menor resolución a voltajes menores
c) A mayor voltaje, mayor difusión lateral
d) Todas son correctos
a) Al incrementar el voltaje, la movilidad aumenta pero no necesariamente la resolución
R =
Hay mejor resolución a voltajes menores
A menor voltaje, mayor difusión lateral
Tiempo de corrida en una electroforesis
- A mayor tiempo de corrida, mayor resolución
- Se debe cuidar que no se salga la muestra del gel
- Entre más tiempo, hay más separación
Temperatura en una electroforesis
- Al incrementarse la temperatura, la movilidad se incrementa como si se hubiera disminuido la concentración de agarosa
- Si la temperatura es muy alta, se puede fundir el gel, por lo que normalmente se mantiene lo más baja posible
- Si la temperatura y la movilidad, el voltaje y el tiempo de corrida aumentan
¿Qué sustancias se usan en el campo de la biología molecular para visualizar ácidos nucleicos en la electroforesis?
- Bromuro de etidio
- SYBR
Bromuro de etidio
- Se intercala entre las bases
- Absorbe a 260 - 360 nm y emite flourescencia de color rojo o naranja a 560 nm
- Detecta hasta 1 ng de dsDNA
SYBR
- NO se intercala
- Alternativa menos tóxica auque menos sensible (3 ng)
Marcadores de peso molecular
Mezcla de ácidos nucleicos de diferente peso molecular que sirve como referencia para el análisis cualitativo de las muestras analizadas
- Sintéticos
- ADN de fagos o plásmidos digeridos por enzimas de restricción (endonucleasas)
