Proteiner som läkemedel Flashcards
Den tysta revolutionen:
Den tysta revolutionen: Detta handlar om en gradvis men genomgripande förändring i hur läkemedel utvecklas och används, särskilt med fokus på proteinbaserade och cellbaserade terapier.
Tidigare har låg molekylära substanser (små molekyler) dominerat läkemedelsmarknaden, exempelvis blodtryckssänkande läkemedel som ACE-hämmare och beta-blockerare. På senare år har peptider, proteiner, mRNA-baserade terapier (t.ex. COVID-19-vacciner som använder mRNA-teknik), och cellterapier börjat ta allt större andelar av försäljningsmarknaden.
En stor del av den snabba ökningen av proteinbaserade läkemedel består av monoklonala antikroppar (mAbs). mAbs, eller monoklonala antikroppar, är en typ av biologiska läkemedel som är framställda av identiska (monoklonala) immunceller. Dessa antikroppar är designade för att känna igen och binda till specifika molekyler, kallade antigener, som finns på ytan av celler eller i kroppen.
Monoklonala antikroppar är identiska antikroppar som produceras av en enda klon av immunceller och riktar sig mot en specifik epitop.
Polyklonala antikroppar är en blandning av olika antikroppar som produceras av flera olika B-celler i immunsystemet. De binder till flera olika epitoper på samma antigen.
Olika stora molekyler:
Olika stora molekyler: Hur dessa LM molekyler skiljer sig åt (Lågmolekylär LM, peptid och IgG antikropp)?
IgG antikropp är en monoklonal antikropp LM.
Låg molekylära molekyler är 30-500 Dalton i storlek
Peptider är 2-50 aminosyror med ungefär 100 Da per aminosyra, därför kan en peptid vara 3000 Dalton
Medan IgG har 150 000 Dalton.
IgG: IgG är en av de vanligaste typerna av antikroppar som finns i blodet och andra kroppsvätskor. IgG har en karakteristisk Y-formad struktur med två antigenbindande områden och en Fc-region (som aktiverar immunceller).
När en IgG-antikropp blir ett monoklonalt läkemedel innebär det att dess struktur anpassas för att rikta sig mot en specifik epitop.
Vilka fördelar/nackdelar har proteiner som läkemedel?
Vilka fördelar/nackdelar har proteiner som läkemedel?
Fördelar:
1- Specificitet: De biologiska läkemedlen är mycket specifika och kan anpassas till kroppens naturliga fysiologiska processer. Substitutionsterapi är en behandlingsform där proteiner används för att ersätta eller komplettera kroppens egna proteiner som saknas eller är defekta på grund av sjukdom eller genetiska störningar.
2- Produktion med rekombinant/bioteknologiska metoder: Rekombinant DNA teknik använder sig av biologiska processer för att producera LM:et. Genom rekombinant DNA-teknik kan biologiska läkemedel produceras effektivt.
3- Proteiner som genterapi, där proteinet fungerar som en direkt terapeutisk molekyl eller som en del av behandlingen.
4- Hög potens: Dessa LM har hög aktivitet och är mer potenta än lågmolekylära LM.
5- Kemisk/biologisk diversitet: Man kan göra en mängd olika molekyler med en enkel och biologiska metod. Proteiner erbjuder en enorm mångfald, vilket möjliggör design av många olika molekyler med hjälp av bioteknik.
Nackdelar:
1- Låg biotillgänglighet vid oral administration: Därför bara administrering intravenöst och intramuskulärt är lämplig. Proteiner bryts snabbt ner i mag-tarmkanalen.
2- Stabilitet (Sur mage): Våra kroppar är utvecklade för att bryta ner proteiner. Många proteiner är instabila i sura miljöer, som magsäcken, vilket gör att de lätt förstörs innan de når målvävnaden.
3- Immungenicitet: Kan neutralisera effekten. Kroppen kan uppfatta vissa proteinläkemedel som främmande och producera antikroppar mot dem, vilket kan neutralisera effekten och orsaka immunreaktioner.
4- Dyr produktion
5- Känn din farmakologi för att det kan leda till toxicitet: Proteinläkemedel kan ha oväntade farmakologiska effekter eller toxicitet som kräver noggrann förståelse och övervakning.
6- Kan inte transfererar mellan olika organismer (Species - Specificitet): Proteiner från en art kanske inte fungerar lika effektivt eller kan orsaka immunreaktioner i en annan art, vilket begränsar deras användning mellan olika organismer.
Halveringstiden kan vara olika för olika biologiska läkemedel. Halveringstiden är lång för antikroppar för att FC göms för enzymatisk nedbrytning. Halveringstiden för antikroppar är cirka 21 dagar, vilket förlänger deras närvaro i blodet. Detta beror på mekanismer som antikropparnas återvinning via FcRn-receptorer, som förhindrar nedbrytning och skickar tillbaka antikropparna till blodomloppet (Recycling). Medan insulin har en kort halveringstid på grund av att det är ett protein som lätt klyvs av kroppens naturliga proteaser, som är utvecklade för att bryta ner proteiner.
Gris insulin skiljer sig från human insulin med en aminosyra och det ledde till immungenicitet. Kroppen kan reagera på denna lilla skillnad och bilda antikroppar mot grisinsulinet. Dessa antikroppar kunde minska insulinets effekt och i vissa fall orsaka allergiska reaktioner.
Humant tillväxthormon (hGH) är det första rekombinanta proteinet, innan hade man extraherat tillväxthormonet från hypofysen från döda människor. Detta ledde till Creutzfeldt-Jakobs sjukdom, ingen bot för sjukdomen. Man såg att detta var ingen bra källa.
Biologin och kemin bakom:
Biologin och kemin bakom:
* Primär: Sekvensen av aminosyror som länkas samman med peptidbindningar
* Sekundär: Vätebindningar mellan ryggradsatomer ger upphov till: α-helix och β-flak
* Tertiär: Den tredimensionella formen av ett protein, Hydrofoba interaktioner, vätebindningar, jonbindningar och disulfidbryggor
* Kvartär struktur: Sammanfogning av flera polypeptidkedjor till en fungerande enhet
- Posttranslationella modiferingar (PTM): Efter translation genomgår proteiner modifieringar för att bli funktionella eller regleras. Vanliga PTM är fosforylering, glykosylering, acetylering etc.
Sidogrupper
Sidogrupper
På de 20 vanliga aminosyror. Dessa sidogrupper kan kännas igen av proteaser som klyvs upp utav. Proteaser är enzymer som katalyserar nedbrytningen av proteiner till mindre peptider och aminosyror.
Exempel på proteaser är pepsin, trypsin. Proteaser klyver positivt laddade aminosyror (Klyver upp proteiner efter varje positivt laddad aminosyra, t.ex. Arginin)
För att förlänga halveringstiden av ett biologiskt läkemedel —> Kan man ersätta det positivt laddade sidokedjan med en annan sidokedja, så länge det ej påverkar effekten av proteinet.
Ozempic: Ozempic (aktiv substans: semaglutid) är en glukagonliknande peptid-1-analog (GLP-1-analog) som används för behandling av typ 2-diabetes och ibland viktminskning. Dess förlängda halveringstid är ett resultat av flera modifieringar som skyddar det från enzymatisk nedbrytning och förlänger dess biologiska aktivitet.
Det humana glukagon har en kort halveringstid på bara 1-2 minuter, men i vissa ödlor har man hittat en liknande peptid som GLP-1 men med längre halveringstid. Detta gav inspiration till utvecklingen av läkemedel som semaglutid.
Post-translationella modifikationer:
Post-translationella modifikationer: Post-translationella modifikationer (PTM) är förändringar som sker på ett protein efter att det har syntetiserats (översatt) från mRNA. Dessa modifikationer är avgörande för att bestämma proteinets funktion, stabilitet, aktivitet och interaktioner med andra molekyler.
1- Glykosylering: N-eller O-bundet socker på Ser, Thr, Asn: Innebär att en eller flera sockergrupper kopplas till ett protein.
2- Fosforylering: Reversibel fosforylering av Ser, Thr, Tyr: där en fosfatgrupp (PO₄²⁻) adderas till en aminosyrarest, vanligtvis på serin (Ser), threonin (Thr) eller tyrosin (Tyr).
3- N-terminal acylering och C-terminal amidering: Man kan ändra änderna på ett protein.
N-terminal acylering innebär att en acylgrupp (ofta en fettsyra) adderas till N-terminalen av proteinet.
C-terminal amidering innebär att en amidgrupp (-CONH₂) sätts till C-terminalen av ett protein.
Acylering och amidering gör man för att skydda proteinet från nedbrytning genom C eller N terminal.
4- Disulfider (disulfidbryggor): Disulfidbryggor är kovalenta bindningar som bildas mellan två cysteinrester, där svavelatomerna i deras sidokedjor binder till varandra och bildar en –S–S–-bindning.
Veckning och struktur
Veckning och struktur
Proteiner är bara aktiva i sin rätta tertiära (tre- dimensionella) struktur
Aminosyrasekvensen kodar för detta, hur det går till är dock okänt i detalj
Oxidativ veckning – formering av disulfider: Oxidativ veckning innebär att två thiolgrupper (-SH) från cysteinrester oxideras (förlorar elektroner) för att bilda en disulfidbrygga.
Insulin
Insulin
Recombinant expression: Rekombinant uttryck innebär att man använder biologiska system för att producera proteiner som inte naturligt förekommer i de organismerna. I fallet med insulin använder man ofta E. coli, jäst eller mammalieceller.
Produktionen - Steg på industriell nivå:
1- Man får gener som kodar för insulin från en genbank, där genetiska sekvenser lagras för olika organismer. För insulinproduktion använder man den sekvens som kodar för humant insulin.
2- Till en oligonukleotid, korta DNA-strängar som kan syntetiseras i laboratorium, kan man introducera selektionsgen (Gen för antibiotikaresistens, GFP), uppreningsgen (HIS-TAG), klyvningsställe.
Antibiotikaresistensgener och GFP-gen är ofta introducerade i plasmiden för att underlätta selektionen av de celler som har lyckats ta upp plasmiden.
En gen som kodar för antibiotika resistens introduceras till oligonukleotid för att detta kan hjälp till att selektera ut bakterier vars dess transformation av plasmider ej har lyckats, då kan endast bakterierna med plasmider överleva.
Ett annat sätt för att selektera bort bakterier där transformationen ej lyckats, är att introducera GFP-gen (Green fluorescent protein), som möjliggör en selektion genom den fluorescerande genen på plasmiden.
HIS-tag kan binda till metalljoner. Detta gör det möjligt att rena det protein som kodas av plasmiden genom affinitetskromatografi, som använder en metallkolonn (IMAC – Immobilized Metal Affinity Chromatography). Eftersom HIS-taggen binder starkt till metalljoner kan du använda en kolonn som är belagd med metalljoner (t.ex. nickel). När bakterierna lyseras och cellinnehållet passeras genom en sådan kolonn, binder proteinet med HIS-taggen till metalljonerna, medan andra proteiner inte gör det.
På kolonnen har vi nu HIS-TAG, antibiotika resistens och målprotein. Ett större protein komplex än det vi vill ha. Klyvningsställe ska vara selektivt, så att de inte klyver för tidigt. Till oligonukleotid kan ett klyvningsställe introduceras, vilket gör det möjligt att klippa bort His-taggen eller andra sekvenser som inte behövs när proteinet har renats. Ett klyvningsställe bör väljas noggrant så att det inte klyvs för tidigt eller på fel ställe i DNA-sekvensen. Efter att proteinet har bundits till kolonnen, kan du tillsätta ett enzym som klyver den oönskade taggen eller andra proteinkomplex, vilket gör att du får det rena målproteinet.
3- Därefter sättas DNA-strängen i en plasmid. DNA-strängen omvandlas till plasmid genom enzymer och ligaser, för att få en cirkulär DNA-sträng. Plasmiden, i sin tur, sätts in i en bakteriecell (T.ex. E.coli) för att bakterier har förmågan att överföra plasmider, är billiga/enkla och möjliggör en snabb upp skalning av insulin produktion. Men andra celler, såsom jäst och mammalieceller kan också användas. Mammalieceller används i syfte att de möjliggör en veckning för insulinet, då ju mer lik är värdorganismen oss, desto mer human-lika proteiner kan man producera. Medan med jäst-celler kan insulin spottas ut.
4- Därefter odlar man bakterierna med plasmiden, så att de blir fler. Där proteinet produceras inuti E.coli cellen i samband med andra proteiner, därför måsta man skörda proteinet med HIS-tag. Man kan isolera proteinet genom att lysera celler och rena upp proteinprodukten.
Exempel insulin:
Exempel insulin:
Insulin molekylen veckar ihop sig med hjälp av disulfidbryggor som håller ihop molekylen. För att dessa kedjor (A och B) ska sitta ihop måste disulfider finns, de är därför viktiga för insulinets effekt.
- Insulin: Har en intressant uttryck i cellerna; Där genen som kodar för insulin genomgår splicing för att introner förvinner, där insulin genen har flera introner. Insulin-gensekvensen har flera introner som tas bort under splicing, vilket resulterar i en mRNA-sträng som kodar för en proinsulin.
Splicing är en process där introner (icke-kodande sekvenser) tas bort och exoner (kodande sekvenser) sammanfogas för att skapa den mogna mRNA-molekylen som sedan används för att producera protein.
Genuttrycket ger upphov till B-C-A kedjor, där C kedjan i mitten (med 35 aminosyror).
Proinsulin består av tre kedjor:
* A-kedjan: Består av 20 aminosyror.
* B-kedjan: Består av 31 aminosyror.
* C-kedjan: Består av 35 aminosyror och finns mellan A- och B-kedjorna.
C-kedjan är viktig, med tanke på att 3 st disulfider kan sättas ihop med 15 olika sätt. C-kedjan förhindrar att A- och B-kedjorna binder felaktigt till varandra och hjälper till att rätt veckning sker. När veckningen är fullständig, klyvs C-kedjan bort, och insulinmolekylen består endast av A- och B-kedjor som är sammanlänkade med disulfidbryggor.
- Från pankreas av gris (1 aa skillnad) och nöt (3 aa skillnad)
– sidoeffekter: Dessa små skillnader kan orsaka sidoeffekter hos människor som får insulin från dessa källor, vilket kan vara en anledning till att man föredrar human insulin. - Konvertera insulin från gris till humant insulin
– C-terminalt alanin ersätts med threonin med enzymatiska metoder - Rekombinant uttryck: Först produceras A- och B-kedjorna separat i bakterier (t.ex. E. coli) eller andra celler genom transformation med plasmider som bär på de önskade generna. När A- och B-kedjorna är producerade, kan de sättas ihop för att bilda den aktiva proinsulin-molekylen. Sedan kan proinsulin genomgå den nödvändiga bearbetningen, där C-kedjan klyvs bort och insulinmolekylen aktiveras.
– Först A och B separat
– Sedan proinsulin - Genteknik
– Förändra sekvens för snabbare insulin: Genom genteknik kan sekvensen för insulin modifieras för att göra det snabbare verksamt. Detta kan göras genom att ändra de aminosyrasekvenser som påverkar insulinets struktur och funktion. Ett exempel på detta är att skapa korttidsverkande insulin genom att förändra insulinets struktur för att förbättra upptaget i blodet och minska fördröjningen i insulins verkan.
Insulin från gris och människa
Insulin från gris och människa
I grisinsulin finns aminosyran alanin.
I human insulin finns aminosyran treonin.
Proinsulin och insulin
Proinsulin och insulin är två olika former av samma hormon, där proinsulin är den inaktiva föregångaren till insulin. De har en liknande grundstruktur, men proinsulin innehåller en extra del, C-kedjan, som förhindrar att A- och B-kedjorna binder till varandra på ett felaktigt sätt. För att proinsulin ska bli aktivt insulin måste C-kedjan klyvas bort genom enzymatisk bearbetning.
Jämförelse produktionssystem -
Jämförelse produktionssystem - Produktionssystem rekombinanta proteiner
1- Prokaryoter:
Bakterier: Hög koncentration (Bakterier kan snabbt växa och producera stora mängder protein), billigt, enkelt, skalbart (Bakterier är lämpliga för stora produktionsvolymer i bioreaktorer), kan ej glykosylera och veckar ej som eukaryota
2- Eukaryoter:
Jäst: Hög koncentration; sekretion (Jäst kan sekretera proteiner till vätskefasen, vilket underlättar rening - Spotta ut), disulfider (Jästceller kan bilda disulfidbryggor, vilket är viktigt för veckning), glykosylering och korrekt veckning möjlig
3- Mammalieceller: Korrekt veckning och PTM, teknikkrävande (Dyrt och långsamt, låga utbyten. Chinese hamster ovary (CHO) cells); Transgena djur (Atryn®)
Transgena djur har förmåga att producera proteiner med korrekt veckning och post-translationella modifieringar som krävs för vissa läkemedel.
4- Växter: Korrekt veckning och PTM, skalbart, ingen risk för humana patogener, kan glykosylera liknande mammalieceller.
Första läkemedlet Elelyso™. Zmapp™.
Kontaminationer:
Kontaminationer: Det som man måste rena proteinet ifrån, samt att säkra kvalité på proteinet.
Typer av kontaminationer:
1- Värd-relaterade: Virus, bakterier, värdrelaterade proteiner/DNA, PTM varianter, endotoxiner
2- Produkt-relaterade: substitutioner av aminosyror, denaturerat protein, isomera konformationer, dimerer/aggregat
3- Process-relaterade: komponenter från odlingsmedium och/eller upprening (tex hormoner, vitaminer), metaller, kolonnmaterial
Läkemedel som är proetiner
Läkemedel som är proetiner
1- Antikroppar (monoklonaler, mAbs)
2- Proteiner, tex HGH, FVIII (glykosylerat, chinese hamster ovary cells, CHO), antitrombin (Atryn®, transgena djur), taliglucerase alfa (Elelyso®), interleukiner, interferoner
Antikroppsutveckling:
Antikroppsutveckling: De flesta är inom onkologi och immunologi.
