Plant cell biotechnology Flashcards
In vitro-kulturer av växter
In vitro-kulturer av växter innebär att växter odlas utanför organismen, i en kontrollerad laboratoriemiljö. Detta sker vanligtvis i sterila förhållanden där växtmaterial som celler, vävnader eller organ (som knoppar eller rötter) placeras i en näringslösning eller ett tillväxtmedium.
Läkemedel av växt ursprung:
Läkemedel av växt ursprung:
Farmakognosi är viktigt för att flera olika läkemedel har växter som ursprung, då de extraheras från växterna:
1- Endast en fjärdedel av dagens läkemedel är helt syntetiska läkemedel som framställs i laboratorier.
2- Revolutionerar biologiska läkemedel hur vi behandlar sjukdomar, och deras utveckling kommer sannolikt att fortsätta växa i snabb takt.
3- Resten av dagens läkemedel har en naturlig ursprung, som kan vara antigen helt naturliga eller semi-syntetiska. Många av dem extraheras från svamp eller bakterier. Många läkemedel har sitt ursprung i naturen men modifieras syntetiskt för att förbättra deras effektivitet, minska biverkningar eller göra dem mer stabila.
4- Idag har vi också flera botaniska källor till läkemedel.
Produktion av molekyler för att behandla sjukdomar på industriell skala är
Produktion av molekyler för att behandla sjukdomar på industriell skala är en komplex process som varierar beroende på molekylens egenskaper:
1- Vissa molekyler kan framställas helt syntetiskt i laboratorier. Här designas kemiska reaktioner för att skapa samma molekylstruktur som finns i naturen. Fördelen med syntetiska molekyler är att det tillåter syntes i stor skala är effektiv och oberoende av naturens begränsningar. Denna process anses alltså vara den ideala processen för produktion.
Ex: Aspirin och Vinkristin.
2- Vissa molekyler är så komplexa att det är svårt att syntetisera dem i laboratorier. Istället kan dessa molekyler isoleras från naturliga källor, som växter. Exempel på en sådan molekyl är Artemisinin, som används för att behandla malaria. Det gav Nobelpris för dess upptäckt. Produktion från växter är beroende av miljöförhållanden, skördetid och andra naturliga faktorer. Detta kan påverka tillgängligheten och kvaliteten.
3- Vissa läkemedel är beroende av växter som inte kan skördas hållbart. Exempelvis Paklitaxel, som är en viktig anti-cancermolekyl som först isolerades från barken av ett träd. Problemet är att trädet måste dödas för att få ut föreningen, och det tar många år att odla nya träd. Den molekylära strukturen av Paklitaxel är också komplicerad och kan ej syntetiseras. Därmed kan molekylen inte biosyntetiseras av bakterier för att molekylens biosyntes kräver flera avancerade tekniker för produktion. Istället för att skörda hela växter används cellkulturer som odlas i laboratorier. Dessa kan producera samma molekyl på ett kontrollerat sätt utan att skada växtpopulationen.
Växt cellkulturer är alltså en viktig metod som används för att överkomma svårigheter vid syntes av essentiella läkemedel.
DICOT är exempel på ett läkemedel vars molekyl faller under den tredje kategorin, där molekylen är komplex och finns naturligt i en växt som ej kan skördas hållbart. Molekylen utvinns av en växt från Madagaskar där molekylen extraheras från rötterna. Problemet är att växten måste dödas för att få ut föreningen, vilket gör produktionen ohållbar. Molekylen kunde hittas i andra organismer, men det gav inga positiva resultat. Därför för att överkomma denna svårighet med produktionen, kan vi använda oss av växt cellkulturer.
Växt cellkulturer - Metod:
Växt cellkulturer - Metod: Är oberoende av miljön och klimat faktorer:
1- Sterilisering av växtmaterialet: Blad, stjälkar, eller rötter kan användas. Frön är dock att föredra, för att fröet är skyddat. Bladet, roten eller fröet skärs i små bitar, där alkohol används för att sterilisera ytan på växtmaterialet. Detta säkerställer att inga kontaminationer förekommer i kulturen.
2- Förberedelse av tillväxtmedium: Växtbitarna placeras på ett tillväxtmedium som innehåller:
* Makronutrienter + Mikronutrienter: Som är viktiga komponenter av växtmediet, t.ex. kväve. Dessa ämne är viktiga för en god tillväxt av cellus vävnaden.
* Carbon källa (Sackaros)
* Agar: En gel som stödjer växtbitarna.
3- Cell växtregulatorer: Adderas också till växt mediet, t.ex. hormoner tillsätts för att stimulera callusbildning (till exempel auxiner, cytokinine och giberelins). Dessa hjälper cellerna att dela sig och bilda odifferentierad vävnad (callus). Av de olika tillväxt regulatorer, kan vi ej prediktera vilken är mest lämplig, med tanke på att beroende på vilken/vilka regulatorer och dess portioner i mediet kan man cellen producera olika komponenter.
4- Tillväxt av cellus vävnaden
Callus är en massa av odifferentierade växtceller som odlas i laboratoriemiljö.
Olika delar av samma växt
Olika delar av samma växt kan reagera olika beroende på vilka tillväxthormoner och regulatorer som används. Olika kombinationer/portioner av hormoner och tillväxtregulatorer kan ge olika typer av callusvävnad, även om de kommer från samma växt. Vissa typer av callusvävnad kan också innehålla proteiner eller andra ämnen som påverkar cellernas metabolism.
Hormoner och växtregulatorer påverkar inte bara utseendet på callusvävnaden utan även cellernas ämnesomsättning och hur de utvecklas.
För att framställa och optimera callusvävnad
För att framställa och optimera callusvävnad krävs experiment med olika kombinationer av tillväxtregulatorer. Processen är komplex, och både kvalitet och kvantitet av önskade ämnen påverkas av dessa faktorer.
Varje typ av callusvävnad kommer från olika kombinationer av tillväxtregulatorer (t.ex. auxiner och cytokininer).
Genom Trial and Error identifierar man den bästa kombinationen av regulatorer för att få högsta möjliga kvalitet och kvantitet av det önskade ämnet.
Fördelar med växt cellkulturer:
Nackdelar med växt cellkulturer:
Fördelar med växt cellkulturer:
1- Oberoende på miljö faktorer/billig metod: Växt cellkulturer har ingen påverkan på miljön. Samt att den anses vara billig, då tillväxtmediet består oftast av socker och grundläggande salter, vilket gör det både billigt och enkelt att skapa. Ingen användning av djurceller behövs, vilket gör processen mer etiskt och ekonomiskt hållbar.
2- Snabb testning av rätt förhållanden: Olika medier och tillväxtregulatorer kan enkelt testas för att optimera den lämpliga och mest optimala kemiska sammansättningen av regulatorer och hormoner. Det gör det möjligt att snabbt undersöka olika variationer i sammansättningen för att hitta de bästa förutsättningarna för callus tillväxten.
Nackdelar med växt cellkulturer:
1- Långsam tillväxt – inte ett praktiskt produktionssystem: Callusodling är långsam, vilket gör den inte lämplig för storskalig produktion.
Vid odling på fasta medier kan callus vävnad utveckla en 3D-struktur som avlägsnar sig från mediumet och dör. Detta sker när vävnaden inte får tillräckligt med näring och syre från mediumet, vilket påverkar växtens överlevnad och tillväxt.
Skala upp växt cellkulturer:
Skala upp växt cellkulturer:
För att göra processen mer effektiv och överkomma problemen med långsam tillväxt och solid mediekultur kan man använda cell suspension som en lösning:
1- Callus från föregående steg: Börja med callusvävnad som odlats på fast medium. Där man använder sig av rätt blandning av tillväxtregulatorer och näringsämnen som har optimerats i tidigare steg.
2- Övergång från fast till flytande medium: Callusvävnaden överförs från ett fast medium till ett flytande medium som innehåller samma kombination av tillväxtregulatorer och näringsämnen. Det flytande mediet möjliggör att cellerna separerar från varandra och delar sig individuellt.
Detta tillåter en jämnare näringstillförsel och bättre tillgång till näringsäme, vilket leder till snabbare tillväxt. Cell suspension är alltså en teknik som möjliggör en enklare anpassning för en storskalig produktion.
Tillämpningar av växt cellkulturer:
Tillämpningar av växt cellkulturer:
1- Karakteristiska egenskaper hos cellsuspension: I cellsuspensionen är dubblingstiden kort, vilket innebär att cellerna växer snabbare, vilket är idealiskt för storskalig produktion.
2- Produktion över tid: Att tillsätta ytterligare faktorer till det flytande medium är viktig för produktion av substanser. Behandling av cellsuspensioner med stresshormoner kan inducera produktion av specifika bioaktiva föreningar.
3- Cellsuspensionen genomgår olika tillväxtfaser, vilket påverkar mängden och typen av föreningar som produceras. Det är viktigt att identifiera rätt fas för insamling, beroende på vilket ämne som är önskat. Med tanke på att insamlingen och dess kvalité beror på näringsämne.
Maximera produktionen utan att kompromissa med kvaliteten. Mer biomassa i slutet av tillväxten betyder inte alltid bättre produktion av det önskade ämnet.
Optimering av produktion i cellsuspension:
Optimering av produktion i cellsuspension:
1- Rätt tidpunkt för skörd: Tillväxtfaser i cellupphängningar påverkar mängden och kvaliteten på det producerade ämnet.
2- Bioelicitors (Stimulering av produktion): Är ämnen som triggar växternas naturliga försvar och ökar produktionen av sekundära metaboliter, såsom läkemedelsämnen.
3- Frisläppande av produkten till mediet: Vissa föreningar produceras inuti cellerna, medan andra kan släppas ut i mediet. Fördelen med produkter i mediet är att blandningen är mindre komplex och därför enklare att isolera och rena.
Stress hormoner är sekundära metaboliter är ofta en del av växternas försvarsmekanismer och kan stimuleras genom att tillföra stressfaktorer till cellsuspensionen. Använd stresshormoner (t.ex. salicylsyra) eller bioelicitors för att stimulera produktionen av specifika föreningar.
Salicylsyra är en viktig bioelicitor.
För att maximera produktionen av en komponent som är kopplad till växtens stressrespons, kan stressfaktorer användas strategiskt i cellkulturen. Stress utlöser växtens försvarsmekanismer och stimulerar produktionen av sekundära metaboliter, som ofta är de önskade ämnena.
Möjlighet till storskalighet - Cellsuspension:
Möjlighet till storskalighet - Cellsuspension:
Cellsuspension är en skalbar lösning som övervinner många av begränsningarna med fasta kulturer:
* Flytande medium gör det möjligt för celler att få jämn tillgång till näringsämnen, syre och tillväxtregulatorer.
* Skapar en homogen miljö, vilket minskar variationen i celltillväxt och metabolitproduktion.
Bioreaktorer och industriell produktion:
Bioreaktorer och industriell produktion:
Bioreaktorer möjliggör kontroll och automatisering av odlingsprocessen, från småskaliga experiment till industriella tillämpningar.
En bioreaktor är en specialiserad behållare där växtceller odlas i flytande medium under kontrollerade förhållanden.
Bioreaktorn fungerar som en sluten miljö där celler odlas i en flytande näringslösning. Utgår från processerna Feeding (Att näringsämnen, syre och eventuella tillväxtregulatorer tillsätts regelbundet för att stödja cellernas tillväxt) och Stirring ( Bioreaktorn använder omrörning för att (1) Hålla näringsämnen och celler jämnt fördelade. (2) Förbättra syreöverföringen till cellerna. (3) Förhindra att cellerna sjunker till botten.
Produktinsamling (output): När cellerna producerar den önskade föreningen kan slutprodukten samlas in från bioreaktorns utflöde.
Olika storlekar på bioreaktorer:
* Småskaliga bioreaktorer (1–10 liter) används för att optimera tillväxtbetingelser.
* Industriella bioreaktorer kan nå upp till 70 000 liter eller mer.
Uppskalning av bioreaktorer: Varje steg kräver optimering. Varje steg i processen kräver noggrann optimering för att säkerställa att cellerna växer och producerar effektivt utan att ta skada.
T.ex.: Vid omrörning (stirring): I småskaliga bioreaktorer är omrörning enklare eftersom volymen är liten och kräver mindre energi. Medan i storskaliga bioreaktorer, behöver man högre energitillförsel för att röra om en större volym, där ökad energi kan skada cellerna.
Bioreaktorer:
Bioreaktorer:
1- Möjlighet till uppskalning: Växtcellkulturer kan skalas upp från små laboratoriekulturer till storskaliga bioreaktorer, som kan vara så stora som 70 000 liter eller mer.
2- Förutsägbar produktion: T.ex: Paclitaxel (en cancerläkemedelskomponent) kan produceras i växtcellkulturer där celllinjen beter sig på samma sätt varje gång, vilket innebär att kvaliteten på produkten är konsekvent, oavsett när den produceras.
3- Fri från humana patogener: När man odlar celler i bakterier eller humana cellkulturer finns det alltid en risk för kontaminering med humana patogener, vilket kräver strikta sterilisations- och rengöringsprotokoll.
Hairy root culture:
Hairy root culture: Är en teknik som används för att producera proteiner, såsom enzymer eller antikroppar, genom att manipulera växtceller.
Hairy roots är en typ av växtvävnad som bildas efter en infektion med Agrobacterium, en bakterie som orsakar onormal rotväxt. Dessa rötter kan användas för att producera värdefulla proteiner, såsom enzymer och antikroppar.
Metod:
* Agrobacterium är en bakterie som naturligt infekterar växternas rötter.
* Bakterien bär på specifika gener som kan överföras till växtens genom. * Dessa gener gör att växten börjar producera hairy roots, en onormal rotväxt som växer snabbt och kan odlas i laboratoriemiljö. * Genom att modifiera Agrobacterium med andra gener, såsom gener som kodar för enzymer eller antikroppar, kan dessa gener introduceras i växtens genom. * Detta gör att växtens celler börjar producera proteiner, som enzymer (från djur eller människor), antikroppar eller andra värdefulla föreningar.
Olika uttryckssystem för produktion av proteiner:
Olika uttryckssystem för produktion av proteiner:
1- Transient Expression: Vektorer är verktyg som används för att föra gener in i organismer, i detta fall bakterier eller virus.
Fördelar: (1) Lätt att manipulera (2) Snabbt uttryck (3) Höga avkastningar (Metoden ger hög produktion av proteiner)
Nackdelar: (1) Begränsad skalbarhet (2) Hög risk för genöverföring till miljön (Eftersom vektorerna är virala eller bakterie-baserade finns en risk att gener sprids i miljön, vilket kan vara problematiskt)
2- Nuclear Expression (Kärn-uttryck):
Fördelar: (1) Flera genetiska manipulationsverktyg
Nackdelar: (1) Tidskrävande
3- Chloroplast Expression (Kloroplastuttryck):
Fördelar: (1) Lägre risk för genöverföring till miljön (2) Höga avkastningar (Eftersom varje cell innehåller många kloroplaster) (3) Lätt att manipulera och motståndskraftig mot att genen tystas ner
Nackdelar: (1) Begränsade transformationsmetoder (Det finns färre metoder för att effektivt införa gener i kloroplaster än för andra uttryckssystem) (2) Inget inhemskt glykosyleringssystem (Växtkloroplaster saknar de enzymatiska vägar som krävs för att utföra vissa typer av glykosylering (en process där sockergrupper läggs till proteiner), vilket kan begränsa produktionen av vissa typer av proteiner som kräver glykosylering).
