Karaktärisering av läkemedesproteiner Flashcards
Biologiska läkemedel (biologicals):
Biologiska läkemedel (biologicals):
* Varierade kategorier av produkter
* Generellt stora och komplexa molekyler
* Isolerade från levande organismer
* T.ex mikroorganismer, växtceller, djurceller, och human plasma
- Exampel på biologicals:
- Kolhydrater
- Proteiner
- Nucleinsyror
- Levande celler
- Vävnad
Skala och Komplexitet:
Skala och Komplexitet:
Biologicals och Små Molekyler
* Acetylsalicylsyra (asperin) = 138 Da
- Insulin: Peptid LM = 51 aminosyror = 5,808 Da
- Monoklonala antikroppar: 4 enheter - 2 light chains och 2 heavy chains.
- ≈ 1330 aminosyror
- ≈ 150,000 Da
Man måste se till få rätt struktur och veckning.
Från läkemedelskandidat till kliniska Studier
Från läkemedelskandidat till kliniska Studier
* När man går från att ha en läkemedelskandidat i labbet till att tillgodose material till en klinisk studie, måste man utveckla en process för tillverkning i stor skala.
- Läkemedelsutveckling är strikt reglerad av olika myndigheter i olika världsdelar:
- USA: Food and drug administration (FDA)
- EU: European Medicines Agency (EMA)
- The International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH): Processerna är reglerade för att underlätta att följa rätta och giltiga reglera kan man följa ICH
ICH: - Har som mål att harmonisera kraven
- Detaljerade riktlinjer för varje steg av läkemedelsutvecklingen och läkemedelsframställningen för att få godkännande.
Definitioner
Definitioner
* Läkemedelssubstans (Eng. Drug substance)
- Den aktiva farmaceutiska ingrediensen som man renar fram från celler och vävnader på organismer
- Slutprodukten från framreningsprocessen
- Startmaterial för läkemedelsprodukten
- Läkemedelsprodukten (Eng. Drug product)
- En eller flera läkemedelssubstanser
- Hjälpämnen/tillsatser
- Startmaterial för den slutgiltiga produkten
- Slutgiltig produkt (Eng. Finished product)
- Den sålda produkten
Framtagning av tillverkningsprocessen
Framtagning av tillverkningsprocessen
Uppskalning av tillverkningsprocessen: labb -> fabrik: ml -> 1000(s) liter
Skapa process som är: Process är ett recept, för att möjliggöra att få exakt samma produkt varje gång. Biologiska LM är dyra, om processen har mindre förlust —> Priset blir lägre.
Därför är det viktigt att skapa en process som är:
Robust
Reproducerbar
Högt utbyte
Hög renhet
Hög aktivitet
Enkel process
Kostnadseffektiv
Olika stadier i LM framställning
1- Kandidat selektion
2- Pre klinisk utveckling
3- Toxicitet studier på djur
4- Kliniska studier på människan (4 faser)
Kliniska studier på människor är dyra. När LM går från kandidat till marknad, måste man undersöka säkerhet och effektivitet med läkemedlet. Ju snabbare man hittar icke-effektivitet eller toxicitet i läkemedlet, desto bättre för att minska risken att slösa pengar.
Framtagning av tillverkningsprocessen
Tillverkningsprocessen ska i stort vara klar innan ”first in human” (FIH)
Framtagning av tillverkningsprocessen
Tillverkningsprocessen ska i stort vara klar innan ”first in human” (FIH), eftersom den slutgiltiga produkten måste ha samma egenskaper som den som testades i de toxikologiska och kliniska studierna.
Om produktionen ändras (t.ex. 1000 L batcher -> 2000 L batches), läkemedelsföretaget måste visa att produkten inte har ändrats.
Toxikologisk studie -> säker dos; Klinisk studie -> effekt
I toxikologiska studier utvärderar man om läkemedlet är toxisk och har biverkningar, men om man ändrar processen har man ändrat på receptet, måste man visa efteråt att det är samma ämne och substans som ska sättas i människa. (Det handlar om uppskalning är därför man ändrar recept)
Processutveckling
* Fyra funktioner/avdelningar:
Processutveckling
* Fyra funktioner/avdelningar:
- Upstream (Producerar material från levande organismer)
- Downstream (Renar fram proteinet)
- Analysis (Utvärderar varje steg)
- Formulering (Bestämmer format på läkemedlet)
Processutveckling:
Optimering av Protokoll + Metod
Processutveckling:
Optimering av Protokoll + Metod
1- Upstream: Cellkulturer, i detta steg fokuserar man på att odla celler som ska producera det önskade biologiska materialet (t.ex. ett protein).
2- Downstream: Preparativ kromatografi: Detta är processen där man extraherar och renar den producerade produkten från cellkulturen. Preparativ kromatografi används för att separera och rena produkten från andra oönskade ämnen (som andra proteiner eller celler), så att man får en ren produkt.
3- Analys: Analytisk kromatografi, i detta steg används analytisk kromatografi för att analysera och kontrollera kvaliteten på den renade produkten.
Processutveckling - Tidslinjer
Processutveckling - Tidslinjer
Mål med optimering:
Nå specifika kriterier inom tidsram:
Utbyte, kostnad, renhet, nivå på specifika föroreningar, etc.
Misslyckad processutveckling:
1) Lägg ned projektet
2) Byt spår:
->Ny version av proteinet
->Annat expressions system (t.ex. bakteria -> djurceller)
Kontaminering och Förorening
Kontaminering och Förorening
Mål: Rena fram ett enskilt protein
Föroreningar är då ämnen som följer med proteinet (t.ex. andra proteiner, kolhydrater, DNA, RNA, fetter, etc.)
Kontamineringar är då smuts som kommer utifrån (t.ex. smutsiga händer, vialer, instrument och maskiner).
Processutveckling: Upstream:
Processutveckling: Upstream:
* Utveckla process för bioreaktor: Där celler växer i
- Skalbar
- Robust: Processen ska fungera pålitligt även om vissa förhållanden varierar, t.ex. temperatur eller näringskoncentration.
- Konsekvent produkt vid variabla mängder: Även om produktionsvolymen förändras, ska slutprodukten alltid ha samma kvalitet och renhet.
- Lämplig för GMP tillverkning
- Får inte vara för komplex
- Hög produktivitet, med låga nivåer av föroreningar
- Bibehålla kvalitet och funktion på proteinet
- Expression systems:
- Bakterier
- Jästceller
- Djurceller
Processutveckling: Upstream
* Jämföra
Processutveckling: Upstream
* Jämföra celllinjer och kloner
* Optimera tillväxtförhållanden (t.ex. media, temperatur, pH)
* Optimera skördningsförhållandena
- Framrening (skörd): Efter att cellerna har producerat den önskade bioprodukten i bioreaktorn måste produkten skördas, som syftar till att separera proteinet från cellerna och andra oönskade partiklar:
- Klarering (centrifugering, filtreringssteg)
- Rena bort celler och celldelar
- Skörda proteinet med ett sista filteringssteg
Processutveckling: Downstream
Processutveckling: Downstream
Målet för framreningsprocessen:
* Få bort föroreningar
- Host cell protein (HCP; ppm): Proteiner från värdcellen som måste avlägsnas.
- Host cell DNA (HCD; ppb): Små mängder DNA från värdcellen som måste bort.
- Produkt aggregering: Undvika att proteiner klumpar ihop sig och blir inaktiva.
- Få bort kontamineringar
- Biologisk börda (Eng. Bioburden; Mängd levande mikroorganismer)
- Endotoxiner (LPS)
- Virus
- Bibehålla produktens funktion och utbyte: Om man värmer protein denatureras dem och då är de inaktiva.
Rening sker med vätskekromatografi (LC-teknik) för att behålla både renhet och funktion.
ppm = parts per million
ppb = parts per billion
Man vill rena produkten så renat som möjligt, men det kan minska mängd produkt, därför måste man balansera. Reningsprocessen måste balansera hög renhet med hög produktmängd, eftersom vissa steg kan minska den slutliga produktutvinningen.
Processutveckling: Downstream
Rening (Eng. Purification)
Processutveckling: Downstream
Rening (Eng. Purification)
1) Minska volymen och föroreningar
2) Flera steg av kromatografi (ofta jonbytkromatografi)
-Så få som möjligt, men inte fler än 3-4 steg
-Nå önskad nivå av renhet
-Minska nivån av föroreningar till målnivåer
3) Slutgiltig koncentrering och buffert byte
Virus:
-Kan introduceras från cellinje, startmaterialet eller operatören (Mänsklig kontakt)
-Steg för inaktivering och filtrering måste inkluderas
Proteinkarakterisering
Proteinkarakterisering
* Under varje steg av framreningen av proteinläkemedlet, samt under processutvecklingen, karakteriseras proteinet med en mängd olika metoder.
- Mål: Att definiera och mäta kvalitetsattribut:
- Egenskaper som kan detekteras och kvantifieras (t.ex. storlek, laddning, struktur).
- Egenskaper som kan relateras till en åtråvärd egenskap (t.ex. stabilitet, biologisk aktivitet, etc)
- Optimeringen av (tillverknings)processen utvärderas sedan med dessa kvalitetsattribut
Proteinkarakterisering av produkten
Proteinkarakterisering av produkten
Kvalitetsattribut för mAb:
1- Aminosyra modifikationer
- Deamidering: Förlust av en aminogrupp, kan leda till förändrad stabilitet.
- Oxidering
- Lysintrunkering: En process där lysinrester (en aminosyra) tas bort eller förkortas i ett protein.
- Blandning av disulfidbryggor
- FC glykosylering: Sockerstrukturer på antikroppens Fc-del påverkar effekt och immunrespons.
2- Strukturella abnormaliteter
- Aggregering
- Felaktig struktur (Eng. misfolding)
- Fragmentering
Dessa förändringar kan ha en direkt påverkan på läkemedlets effektivitet, säkerhet och hållbarhet. Proteinkarakterisering hjälper till att säkerställa att varje batch är konsekvent och uppfyller regulatoriska krav.
Möjlig korrelation till aktivitet, stabilitet och/eller immunigenitet.
Trunkering: Heavy Chain av mAb
Trunkering: Heavy Chain av mAb
Trunkering av heavy chain (tung kedja) av monoklonala antikroppar (mAb) innebär att den fullständiga sekvensen av tung kedja i antikroppen inte är intakt utan har genomgått en förkortning eller borttagning av vissa delar av kedjan.
Detta kan hända genom genetiska mutationer eller post-translationella modiferingar.
Metoder som används för proteinkarakterisering
Metoder som används för proteinkarakterisering
1- Kvantifiering:
UV spektrofotometri (A280 nm): För att känna till vilken mängd man har.
2- Renhet:
- Gel elektrofores (1D SDS PAGE): För att känna till molekylvikt, prov komplexitet (Om det är många proteiner eller ett protein).
- Size exclusion chromatography (SEC): Komplex storlek: monomer, dimer, trimer, etc.
- Reverse phase chromatography (RPC): Metoden baseras på hydrofobiska interaktioner: förtopp(ar), huvudtopp, eftertopp(ar).
- Isoelektrisk fokusering/jonbytarkromatografi Laddningsbaserad heterogeneitet.
3- Fysikaliska egenskaper:
- Dynamic light scattering (DLS): Aggregering för att man vill inte ha aggregering.
- Differential scanning fluorimetry (DSF: Smälttemperatur/strukturell stabilitet.
Föroreningar och kontaminering
Föroreningar och kontaminering
Föroreningar: Antigen Cellrelaterade eller processrelaterade:
1- Cellrelaterade:
* Host cell DNA: Metoden: qPCR.
* Host cell proteins: Metoden: ELISA, LC-MS.
2- Processrelaterade (mAb)
* Resisterande protein A: Metoden: ELISA. Protein A används ofta i reningsstegen av mAb. Om det inte tas bort ordentligt kan rester av protein A finnas kvar i produkten.
* Insulin: Metoden: ELISA. Om insulin används i produktionsprocessen kan det bli en förorening om det inte tas bort helt.
Kontamineringar:
* Bioburdan*: Metoden: TAMC/TYMC.
* Endotoxin: Metoden: LAL assay.
Kan orsaka reaktion i patient! Kan ge immunogenicitet, feber, sjuk eller döden.
*Bioburdan: Mängd av levande mikroorganismer.
Kontaminerade läkemedel - Blödarsjuka:
Kontaminerade läkemedel - Blödarsjuka: Saknar VIII i koagulerings kaskad.
* Blödarsjuka saknar proteinet faktor VIII i blodet -> blodet koagulerar inte
* Från 60-talet behandlades patienter med donerad plasma (människa)
* I slutet på 1970-talet till 1985 såldes faktor VIII kontaminerat med HIV och hepatit C ->6000-10000 blödarsjuka i USA smittade med HIV, man donerar blod för pengar, därför hemlösa var med.
* I början på 90-talet började faktor VIII produceras som rekombinant protein (celler).
-> Protein, framrenat från blod, kontaminerat med virus (sjuk bloddonator)
Aktivitetsbaserade analyser
Aktivitetsbaserade analyser
* Nödvändigt att mäta verkningsmekanismen.
* Ofta cellbaserade metoder.
* Exakt typ av metod beror på den exakta verkningsmekanismen hos proteinet.
Exempel av metoder för mAb: Allt beror på vad vi vill att proteinet ska göra:
- Antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet: Innebär att antikroppen binder till en målcells antigen (t.ex. en cancercell), vilket leder till att immunceller (som NK-celler) känner igen och dödar målcellen.
- Komplement beroende cytotoxicitet: Innebär att antikroppen binder till en antigen på målcellen, vilket aktiverar komplementkaskaden och leder till cellskada eller celldöd
- Apoptos
- Binding till target på celler:
- Binding till target – binding eller blockering av lösligt target
Mass spectrometri baserade metoder
Mass spectrometri baserade metoder
* Proteinmassa: Masspektrometri används för att mäta massan av proteiner, vilket gör det möjligt att identifiera och kvantifiera dem.
- Peptidmappning:
- Sekvenstäckning (Eng. Sequence coverage)
- Post-translationella modifikationer (PTMs)
- Glykopeptider: Glykopeptider är peptider som är glykosylerade, det vill säga har en eller flera sockerenheter (kolhydrater) bundna till sig.
- Terminal sekvensanalys: Terminal sekvensanalys används för att bestämma de sista aminosyrorna i en polypeptidkedja, särskilt vid C- eller N-terminalen.
- Icke-reducerad peptidmappning för att mappa disulfidbryggor
- N-linked oligonucleotidanalys: Masspektrometri används för att analysera dessa glykosylerade proteiner och för att skapa en global kolhydratprofil.
- Global karbohydratprofil: Den globala kolhydratprofilen syftar till att identifiera och karakterisera alla de kolhydrater som är kopplade till ett protein
Liquid Chromatography (vätskekromatografi):
Liquid Chromatography (vätskekromatografi):
1- Off-line chromatography: I off-line kromatografi samlas eluaten (den separerade substansen) från kromatografikolonnen in i fraktioner innan det analyseras vidare med en annan teknik.
2- On-line chromatography: I on-line kromatografi kopplas kromatografisystemet direkt till ett analysinstrument, exempelvis en UV detektor.
Hypotetiskt exempel 1: Minskad aktivitet på grund av förtoppar i Reverse Phase Chromatography:
Hypotetiskt exempel 1: Minskad aktivitet på grund av förtoppar i Reverse Phase Chromatography:
1- Lägre aktivitet: Observation —> Mer förtopp leder till lägre aktivitet (t.ex. inaktiv form av proteinet).
2- Högre aktivitet (100%): Lösning —> Endast samla fraktioner med huvudtoppen (ökad renhet, men lägre utbyte).
Optimiseringsteg: Downstream/Purification
Vid analys av ett protein med Reverse Phase Chromatography (RPC) observeras att förtopp(ar) leder till en minskning av proteinets biologiska aktivitet. Detta kan bero på att förtoppen innehåller en inaktiv form av proteinet.
Hypotetiskt exempel 2: Minskad Aktivitet från trunkering
Hypotetiskt exempel 2: Minskad Aktivitet från trunkering
1- Observation: En trunkerad (klyvd) form av proteinet bildas under framreningsprocessen -> reducet utbyte + förorening som måste tas bort.
Närvaro av en förtopp som tyder på en trunkerad form av proteinet.
Lösning:
1) Mutera aminosyra sekvensen för att ta bort sekvensen känslig för klyvning: Om trunkeringen orsakas av en specifik proteolytisk klyvningssekvens, kan denna region muteras eller modifieras för att förhindra klyvning.
Eller
2) Byta cellinje till en utan proteaset som orsakar
Klyvningen: Om trunkeringen orsakas av ett värdcellsproteas, kan problemet lösas genom att ändra cellinje.
Optimiseringssteg: Upstream/klon eller cellline
Hypotetiskt exempel 3: Öka aktiviteten genom att modifiera FC kolhydratprofilen
Hypotetiskt exempel 3: Öka aktiviteten genom att modifiera FC kolhydratprofilen
1- Lägre aktivitet: Observation —> Halveringstiden i blod kan förlängas genom att modifiera kolhydratprofilen (kunskap från experiment eller litteratur)
Kolhydrater på FC-delen är avgörande för stabiliteten och immunologiska effekter. Om kolhydratprofilen inte har rätt sammansättning kan det leda till snabbare clearance, vilket minskar effekten av behandlingen.
2- Lösning: Ändra sammansättningen av mediet.
Optimiseringssteg: Upstream/Tillväxtförhållandena
Hypotetiskt exempel 4: Närvaro av Host Cell Proteins (HCP)
Hypotetiskt exempel 4: Närvaro av Host Cell Proteins (HCP)
1- Observation: Produkten innehåller en mindre komponent av HCP som är svår att rena bort helt: t.ex. Annexin A2 under mAb rening -> Risk för immunogenicitet
2- Lösning: Skapa (eller köpa) deletion/knock-down version av celllinjen
Optimiseringssteg: Upstream/expression systemet
Mass Spectrometri: Intakt Massa
Mass Spectrometri: Intakt Massa
* Massspectrometri (MS) mäter laddade partiklar i gasfas: massa delat med laddning (m/z)
- Proteiner är stora och kan acceptera många laddningar (protoner) under joniseringen => Charge state envelope
Charge State Envelope (CSE) är den grupp av toppar som representerar samma protein i olika laddningstillstånd. Dessa toppar är regelbundet fördelade på grund av att ett och samma protein kan få olika antal protoner under joniseringen.
Ju fler laddningar (laddningstillstånd) proteinet har, desto kortare blir avståndet mellan topparna.
Avståndet mellan topparna varierar och beror på laddningen (kortare till längre)
Avståndet mellan alla isotoper är 1Da / laddning
Beräkning av neutral intakt massa
Beräkning av neutral intakt massa
Laddningen (z) på varje top i “charge state envelope” kan bestämmas från:
1) Avståndet mellan isotoper
2) Avståndet mellan toppar (“charge states”)
Normalt beräknas massan av ett program
Peptidmappning med LC-MS:
1) Peptididentifiering
Peptidmappning med LC-MS:
1) Peptididentifiering
Peptididentifiering:
* Protein klyvs av proteaser (t.ex. trypsin) för att skapa peptider
* Peptiderna separeras med on-line reverse phase chromatography
* Precursormassan bestäms i MS
* Fragmentmassorna bestäms i MS/MS
* Peptidsekvensen bestäms av databassökningar
Peptidmappning med LC-MS:
2) Peptididentifiering
Under en databassökning
Peptidmappning med LC-MS:
2) Peptididentifiering
Under en databassökning är varje MS/MS spektrum tillsammans med dess ”precursor” massa (dvs peptidmassa) jämförd med teoretiska spectra och rankade enligt antalet matchade fragment.
Bäst rankade sekvensen = peptide ID
Peptidmappning med LC-MS:
3) Identifiering av modifierade peptider
Peptidmappning med LC-MS:
3) Identifiering av modifierade peptider
Modifierade peptider är identifierade på samma sätt som omodifierade peptider, med skillnaden av att man tar hänsyn till modifikationsmassan
Peptidmappning med LC-MS:
4) Kvantifiering av identifierade peptider
Peptidmappning med LC-MS:
4) Kvantifiering av identifierade peptider
* Peptidmassan (m/z) av varje identifierad peptid är extraherad
* Arean är integrerad
* Den relativa mängden räknas ut i %
Peptidmappning
Peptidmappning
* Sekvenstäckning = Identifierad sekvens jämförd med hela sekvensen(%)
* Modifieringar
- Relativ mängd (% av totala mängden peptid) per site. Mäter hur stor andel av proteinet som är modifierat vid en specifik site (% av totala mängden peptid).
- Oxidering
- Deamidering
- Blandning av disulfidbryggor
- Peptider kors-länkade av disulfidbryggor identifieras på samma sätt som omodifierade peptider
Masspectrometri-baserade metoder summering
Med MS, är det möjligt att:
Masspectrometri-baserade metoder summering
Med MS, är det möjligt att:
* Mäta massan av proteiner (inom 1 Da avvikelse)
* Detektera addition av enskilda atomer (t.ex. oxidering)
* Identifiera peptider (både omodifierade och modifierade)
* Bestämma den relativa mängden av modifierade sites
Mozzarella
Mozzarella
De väger olika
Så länge vi ser flera toppar —> Förfalskad
Formulering:
Formulering:
Mål: Att hitta den bästa möjliga buffert för att stabilisera den framrenade produkten under ytterligare bearbetning, fyllning, distribution, förvaring och administrering
Buffert: Innehåller
* Detergenter: Motverka aggregering.
* Hjälpämnen/tillsatser: Motverkar fragmentering/trunkering.
* pH, jonkoncentration: Motverka modifikationer.
* Buffertyp (t.ex. fosfatbuffert): Motverkar kompatibilitetsproblem.
Formulering - Stabilitetstestning
Formulering - Stabilitetstestning
* Etablera hållbarhet:
- Måste vara baserad på verklig data
- Etablera adekvata förfaringsförhållanden: Rumstemp
- Vätska (5, 25, 40°C), fryst, torkad
- Bestämma förpackningens lämplighet:
- Interagerar proteinet med förpackningen (t.ex. glasvial + gummiplugg)?
- Dos och säkerhet:
- Kemisknedbrytning av läkemedelsprodukten: Om kemisk modifikation uppstår kan det orsaka till biverkningar
-> minska koncentrationen av den aktiva substansen
-> kan leda till att giftiga biprodukter bildas
Forced Degradation Studies (FDS)
Forced Degradation Studies (FDS)
* FDS är ett viktigt steg när korrekt formulering tas fram
- Målet är att identifiera nedbrytningsvägar och stabilitetsindikerande metoder
- Testa många stressförhållanden för att bestämma lämplig stress för den specifika produkten (t.ex. pH, värme, UV ljus, etc)
- Målet: Stressa proteinet så att 85-90% återstår
- Korrelera instabiliteten till aktivitet
- Definiera relevanta metodset, innan ett större antal formuleringar utvärderas
- Behållare och lock
- Samma som för den kommersiella produkten
- Interaktion mellan protein, behållare och/eller lock kan ske -> måste testas
Specifikationer
1- Preklinisk utveckling: Processen för framställning optimeras och fastställs. Många analysmetoder. Ett mindre urval används för senare steg.
2- Kliniska studier (Fas I, II och III): Processen används för att ta fram material till de kliniska studierna. Varje batch analyseras och variationen mellan batcherna används för att sätta specifikationerna för läkemedlet.
3- Marknad: Processen används för material som ska sälja på marknaden. Specifikationen används för att säkerställa kvaliteten. ->release metoder
Specifikationer
1- Preklinisk utveckling: Processen för framställning optimeras och fastställs. Många analysmetoder. Ett mindre urval används för senare steg.
2- Kliniska studier (Fas I, II och III): Processen används för att ta fram material till de kliniska studierna. Varje batch analyseras och variationen mellan batcherna används för att sätta specifikationerna för läkemedlet.
3- Marknad: Processen används för material som ska sälja på marknaden. Specifikationen används för att säkerställa kvaliteten. ->release metoder
Sammanfattning
Sammanfattning
* Preklinisk läkemedelsutveckling involverar upstream, downstream, analys och formulering
- Proteinkarakterisering behövs vid alla steg för att säkerställa kvaliteten
- Optimerad formulering behövs för optimal stabilitet
- Hållbarhet och förvaringsförhållanden bestäms genom stabilitetstestning
- FDS är en viktigt sätt att bestämma vilka attribut som behöver mätas och vilka metoder som bör användas
