Intro Testa center Flashcards
Skillnad mellan traditionellt (lågmolekylära läkemedel) och biologiska/vaccin läkemedel:
Skillnad mellan traditionellt (lågmolekylära läkemedel) och biologiska/vaccin läkemedel:
Traditionella läkemedel:
- De traditionella läkemedlen består oftast av mindre än 50 atomer
- Kvalitetskontroll (QC) av produktionen sker i slutet stadiet av produktionen, där man undersöker att molekylen uppfyller krav för effektivitet och säkerhet, samt att ingående atomer ligger rätt i förehållandet till varandra.
Biologiska läkemedel:
- De biologiska läkemedel/vaccin består av flera atomer.
- På grund av de flera antal atomer ingående i biologiska läkemedel, är det svårt att undersöka kvalitet, molekylen och förehållandet till dess enheter, därför sker kvalitetskontrollen (QC) över hela processen.
Biofarmaceutisk tillverkning:
Biofarmaceutisk tillverkning:
1- Upstream (USP): Odling av celler. Detta är den inledande fasen där man odlar celler som producerar det biologiska läkemedlet. Cellerna växer i ett näringsrikt medium under kontrollerade förhållanden för att optimera produktionen av den önskade molekylen.
2- Midstream: Skörd och separation. I denna fas skördas produkten. Separationstekniker används för att skilja cellerna från mediet, exempelvis filtrering.
Celler och medium separeras, beroende på om produkten finns:
- I mediet (extracellulär produkt).
- Inuti cellerna (intracellulär produkt).
3- Downstream (DSP): Reningsprocess. Den skördade produkten renas för att uppnå hög kvalitet och säkerhet. Här avlägsnas föroreningar som cellrester, proteiner, DNA eller andra oönskade komponenter.
Olika krav och egenskaper
Olika krav och egenskaper gäller för produktion och analys av proteiner beroende på deras användning, från forskning till terapeutiska tillämpningar.
1- För Masspektrometri: Mindre volym kan man arbeta med (Små volymer räcker för analys), låg renhet (provet behöver inte vara rent - låg renhet är acceptabel), aktivitet och homogenitet är inte nödvändiga.
2- För Terapeutiska proteiner: Högre volymer krävs, med hög renhet, hög aktivitet och hög homogenitet.
Gener i en plasmid:
Gener i en plasmid:
1- Selektivitetsmarkör i en plasmid: Exv. Antibiotikaresistens ifall man har bakterieceller. Används för att selektera celler som tagit upp plasmiden.
2- Promotor: Styr uttryck, ökat uttryck. Ger möjlighet att öka eller justera mängden av det uttryckta proteinet.
3- Affinitets/löslighets-tagg: Hjälper till med rening och/eller löslighet av proteinet. Om något inte löser sig så snabbt kan en löslighets-tagg introduceras till plasmiden:
* Exv. Histag: Metall jon affinitet.
* SUMO: Hjälper med löslighet
* Klyvningsställe för tag: För att klyva de oönskade proteinkomplex, där man efter reningssteg klyvs protein komplexet.
4- Multiple cloningsite (MCS): Den genen man vill uttrycka. Innehåller flera unika restriktionsställen för enkel infogning av genen.
5- Terminator: Slutet. Markerar slutet av transkriptionen.
Var proteinet uttrycks avgör
Var proteinet uttrycks avgör hur “skörd” går till
* Cytoplasm: Inuti cellens cytoplasma
* Periplasm: Mellan det inre och yttre membranet i gramnegativa bakterier.
* Extracellulär: Proteinet utsöndras utanför cellen (i tillväxtmediet).
Kontrollera att rätt plasmid
Kontrollera att rätt plasmid tagits upp i de resistenta kolonierna.
* PCR
För att bakterier ska kunna ta upp plasmiden, blandar man bakteriekulturer med plasmider —> Heat shock, Heat shock används för att öppna cellmembranen och tillåta plasmiderna att tas upp av bakterierna.
Därefter odlar man dem i ett medium med antibiotika, där bara kolonier som tagit upp plasmiden klarar sig. Endast de bakterier som tagit upp plasmiden (med antibiotikaresistensgenen) överlever och bildar kolonier.
Det finns en risk att plasmider som ej tagit upp genen sluter sig i en cirkulär DNA, då har dessa antibiotika resistens men inte den önskade genen, detta kan kontrolleras med PCR och sekvensering. Dessa plasmider överlever selektionen men har inte den gen man vill uttrycka.
Cellbank: Har ett syfte att upprätthålla och förvara celler/genom för forskning och produktion. En cellbank gör det möjligt att ha samma utgångspunkt varje gång du startar en process. Cellbanken lagras i ultrafrysar vid låga temperaturer för långvarig stabilitet. Om cellbanken går förlorad, måste hela processen för att utveckla cellerna startas om.
I akademiska sammanhang
I akademiska sammanhang och forskning, har vi en småskalig produktion, där produktionsstegen kan uppstå i små glas kolvar. Där typiska volymer är milliliter till några liter.
Medan för en storskalig produktion används Bioreactorer som kan innehålla från 1 liter till flera tusen liter, upp till “oändliga volymer” beroende på industriella behov.
Seed train:
Seed train: Tillräcklig antal celler för att starta produktionsprocessen. Syftet med Seed train är att man går från produktionen i vial till större flaskor, och till sist i bioreaktorer. Där man vill ha tillräckligt många celler för en snabbare och effektivare protein produktion.
Stirtank bioreaktor:
Stirtank bioreaktor: Är en typ av bioreaktor som används för att odla celler, mikroorganismer eller andra biologiska system i kontrollerade förhållanden. Man odlar celler som kontrollerar pH, syre, temperatur och hur snabbt är rörelsen av mediumet etc. Man kan ha slangar, antingen för att ta prover (Output) eller för att ändra kemiska egenskaper (Input). Man kan tillsätta näringsämne, detta gör att man får högre utbyte.
Input: För att främja celltillväxt eller produktion av specifika ämnen kan näringsämnen (t.ex. glukos, aminosyror, vitaminer) eller andra kemikalier (som baser, syror eller tillsatser som påverkar metabolismen) tillsättas genom slangar i systemet. Dessa tillsatser ökar ofta utbytet och cellernas effektivitet i produktionen av önskade substanser.
Output: Provtagning är viktigt för att övervaka bioprocessen. Detta görs genom att samla prov av mediumet vid olika tidpunkter för att analysera celltillväxt, näringsnivåer, pH, syre och andra faktorer.
Rocking motion/wave bioreactors:
Rocking motion/wave bioreactors:
Rocking motion/wave bioreaktorer är en alternativ typ av bioreaktorsystem som använder en skakande rörelse för att skapa en våg-liknande effekt i cellodlingen. Denna typ av bioreaktor är särskilt användbar för känsliga celler, som mammaliska celler, som lätt kan skadas av den mekaniska omrörningen i stirtank bioreaktorer.
Rörelsen resulterar i ett blandningsflöde, där gasutbytet sker effektivt utan att cellerna utsätts för intensiv mekanisk påverkan. Där gasutbytet uppstår med hjälp av wave rörelsen
Antal bakterieceller skiljer sig
Antal bakterieceller skiljer sig beroende på om cellodlingen sker i en skakflaska eller bioreaktorer:
OD-värde (Optical density): Motsvarar cellmassan, den anger antal celler/volymenhet medium. Värdet är alltså relaterad till cell densitet.
I en skakflaska är OD-värdet mycket lägre än OD-värdet i en bioreaktor. Därmed möjliggör en bioreaktor att man pumpar in/för in näringsämne (Fed-Batch), som gör att vi får ett högt OD-värde. Där varje cell utvecklar ett protein —> Flera proteiner bildas.
Näringsämnen: Tillförs gradvis via Fed-Batch-teknik, vilket förlänger exponentiell tillväxtfas och ökar celltätheten.
Single use:
Single use: Cellodlingen sker i en plastpåse (t.ex. bioreaktorpåsar). Påsarna är sterila och strålbehandlade för att eliminera risken för kontaminering. Efter användning kasseras påsen istället för att rengöras och återanvändas. En nackdel är miljöaspekten, särskilt den stora mängden plastavfall som är en betydande nackdel. Men samtidigt minskar användningen av vatten, kemikalier och energi som krävs för rengöring.
Harvest/midstream/skörd
Harvest/midstream/skörd
* Första steget i upprening
Stora volymer?: På grund av stora volymer kan man inte centrifugera, därför lyserar man bakterie cellerna med French press.
- Var uttrycks proteinet av intresse?
Media?
Intracellulärt? Lysera cellerna/Homogenisera – French press (Att pressa celler och få ut proteinet), sonication (Ultraljudsvågor används för att bryta cellväggarna).
Om proteinet är lokaliserat inuti bakterieceller krävs lysering (cellnedbrytning) för att frigöra det. - Skilja celler/celldelar från media: Filtrering. När celler har lyserats eller proteinet redan finns i mediet krävs en separation av proteinet från cellrester och andra partiklar. På grund av stora volymer används ofta filtreringsmetoder snarare än centrifugering. Man skiljer proteinet från cell-enheter:
1- Djupfiltrering (tänk konventionell filtrering): Man pressar genom filter. Använder filter som fångar upp partiklar (cellrester) medan lösningen med proteinet passerar.
2- TFF tangential flow filtration: Vätskan flödar tangentiellt (parallellt) mot filtret.
3- Continuous filtration (alfa laval, mjölkseparator): Möjliggör kontinuerlig separation av cellrester och proteinlösningar vid storskalig produktion.
TFF:
TFF: (Tangential Flow Filtration) är en filtreringsteknik som skiljer sig från djupfiltrering genom att vätskan flödar parallellt med filtret snarare än rakt igenom. Detta designval gör det särskilt effektivt för att hantera stora volymer och undvika igensättning av filtret. Vätskan som innehåller proteinet och andra komponenter flödar längs med membranets yta (tangentiellt). Membranet är designat för att selektivt släppa igenom molekyler baserat på storlek
Continuous centrifugation:
Continuous centrifugation: Continuous centrifugation är en teknik där separation sker i en roterande centrifug som arbetar kontinuerligt. Vätskan som innehåller partiklar matas kontinuerligt in i centrifugen. Mjölk innehåller både grädde och skummjölk. Grädden kan separeras från skummjölken i en centrifug.
