Intro Metodseminarium Flashcards
Produktion av polyklonala och monoklonala antikroppar:
Produktion av polyklonala och monoklonala antikroppar:
1- Polytklonala antikroppar: Ett antigen (t.ex. ett protein) injiceras i ett försöksdjur (vanligtvis en mus). För att förstärka immunresponsen ges flera upprepade injektioner (boosters).
Antikropparna renas ofta med hjälp av en affinitetskromatografikolonn, där de binder till antigenet och separeras från andra proteiner i blodplasman.
2- Monoklonala antikroppar - Framställning med hybridomteknik: Ett antigen injiceras i en mus, vilket stimulerar dess B-lymfocyter i mjälten att producera antikroppar mot antigenet. Efter en viss tid isoleras mjälten från djuret, där B-cellerna nu producerar antikroppar mot antigenet.
Mjältceller är dock kortlivade utanför kroppen, därför fuseras (smälter samman) mjältecellerna med myelomceller (en sorts odödlig cancercell).
Cellerna odlas i HAT-medium, där endast hybridomceller (fusionerade celler) överlever, eftersom de har ärvt både myelomcellens odödlighet och mjältcellens HGPRT-enzym.
Myelomceller saknar enzymet HGPRT (hypoxantin-guanin-fosforibosyltransferas), vilket innebär att de inte kan producera nukleotider.
Primär vs sekundär antikropp
Primär vs sekundär antikropp
* Primär antikropp:
- Binder direkt till antigenet
- Kan i vissa fall vara konjugerad: Med fluoroscence/enzymatisk/etc
- Sekundär antikropp: Binder till den primära antikroppen Binder till (ofta) Fc-delen.
- Ofta konjugerad till funktionell grupp/aktivitet
- Enzymatisk aktivitet
- Fluoroscense: En signal sätts oftast på en sekundära antikroppen.
Den primära antikroppen har en monoklonala ursprung, medan den sekundära antikroppen har en polyklonal ursprung.
En sekundär polyklonal antikropp kan binda flera ställen och om varje antikropp har en signal på sig, får man en dubbel signal.
Blocking
Blocking
Om man coater plattor med antigen, kan nakna plaster finns, och vi ska se till att inget finns där, där man använder en
Dot blot:
Dot blot: Enklaste metod, en platta med membran och vi droppar prov med antigen vi vill upptäcka och blcokeraer hela membranet,
* Simplistisk application
* Membran som binder analyten
* Ex.v. nitrocellulose
- Applicera prov (liten yta)
- Blockera alla oanvända bindningsställen
- (blocking, ex.v. BSA)
- Applicera Ab
- Tvätta
- Applicera sekundär antikropp
- Tvätta
- Framkalla: Tillsätter något som ger färg.
- Stoppa enzymaktivitet → avläs signal
Skillnad mellan den och det övre är att vi gör detta på membran.
Western blot:
Western blot: Två metoder som sitter ihop:
1. Elektrofores: Att man använder gel som proteiner vandrar i i en elektimagnet fält
2. Blot: Man överför prtien till membran och
* Bind med primär Ab
* Bind primär Ab med sekundär Ab
* Läs av signal
Northern blot – RNA
Southern blot – DNA
Eastern blot - ?? Modifications, lipids etc??
Transfer to membrane
Man tar gel och sitt me,bran och man flytter över och låter pteien på gelen på sidan på gelen.
Elektrofores: Separera proteiner utifrån storlek.
Blot: Föröver från gel till membran.
Proteiner separeras genom elektrofores, överförs till ett membran, och detekteras med antikroppar. En primär antikropp binder till målantigenet, och en sekundär antikropp med en enzym- eller fluorescensmarkör används för visualisering.
Alla proteinet i gelen överförs till membran och man dit
Binder till FC-regionen (Sekundär antikropp). Detektionsantikropp.
Substrat och enzym —> Fluocerans.
Fördelar: Specificitet, Möjlighet att analysera protein modifieringar.
Nackdelar: Tidskrävande, dyr,
Semi kvantitav
Blandar protein med SDS
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
* Assay designed for detecting and quantifying soluble substances
* High affinity and very specific antibodies that allow target antigen to be captured
* It can be used on both crude cell extracts (supernatants) from cell cultures, serum/plasma from human blood or highly purified peptide/protein/antibody solutions
Dekterar och kvanaitfera lösliga protein
Antikroppar används
Så långt något är lösligt kan vi använda den
Different flavours of ELISA
1- Direct ELISA
Different flavours of ELISA
1- Direct ELISA
* Primary antibody is conjugated with the enzyme/signal
Är en nkel metod som Dot plot men är i lösking
Antoeg är coasted, man tvättar och man sätter promär antikoppen är detektionsantikropp och binder till antigennet, därdör dirket ELISA.
Ett antigen fästs direkt på en yta, och en enzymmärkt antikropp tillsätts för att binda antigenet. Enzymreaktionen genererar en färgförändring som mäts spektrofotometriskt.
Nackdelar: Kostsam
Different flavours of ELISA
* Indirect ELISA
Different flavours of ELISA
* Indirect ELISA
* Secondary antibody is conjugated with the enzyme/signal
Antigen i brunn, vi tvättar, prmär, tvättra och sätter sekunär antikropp med enzym och däreter tvättar man
Indirekt Det är billigare att för att primöra är dyra att ta fram och spevifika för proteinet de är tillverkade emot. Sekundär antirkopp mot primära, kan sekundäa används mot olika pirmöa antirkoppar.
Ett antigen immobiliseras på en platta, en primär antikropp binder antigenet, och en enzymmärkt sekundär antikropp används för detektion.
Fördelar: Mindre kostsam, känsligare (Mindre konc.)
Nackdelar: Högre risk för bakgrund. Större risk för ospecifik bindning (kors bindning).
Båda direkt och indirekt är lika specifika.
Different flavours of ELISA
2- Sandwich ELISA
Different flavours of ELISA
2- Sandwich ELISA
* Well coated with Ab
* Antigen
* Enzyme-linked secondary Ab, binds antigen
* Requires 2 Abs that bind the antigen differently
Istället dör att coata antigen, coaster vi antirkopp och tvättar och antieg sätts och tvättar och vi sätter en till primära natikrppp och sedan sätter man substrat och man får signal.
Specifik ELISA än andra ELISA, man binder till antigen på olika eptitoper, två ställen på proteinet stämmer
Sandwich k
En fångstantikropp immobiliseras på en yta, antigenet binds till den, och en detekterande antikropp (ofta enzymmärkt) används för att mäta antigenet.
Specificitet högre än andra ELISA, för att antigenet behöver två bindningsställe. 2 epitoper på proteinet.
Primära är av monoklonal ursprung
Sekundär är av polykolonal ursprung
4 key parts
4 key parts
* Coating/capture–direct or indirect immobilization of antigens to the surface of polystyrene microplate wells
* Usually PBS or carbonate-bicarbonate buffer
- Plate blocking–addition of irrelevant protein or other molecule to cover all unsaturated surface-binding sites of the microplate wells.
- Usually 1% BSA in PBS
- Probing/detection–incubation with antigen-specific antibodies that affinity-bind to the antigens.
- Usually 0.1% BSA in PBS 0.05% Tween-20
- Signal measurement–detection of the signal generated via the direct or secondary tag on the specific antibody.
- Between each step wash with PBS 0.05% Tween-20 to remove any unspecific binding
4 st steg i ELISA:
1- Coating: Att man antigen coatear antig eller antikropp
2- Blocking: irrelavamt protein som blcokarar ytor som tänks binda på, ofta albumnin. BSA är väl karaktiserat.
3-
4- Mäter signalen
5: Elisa handlar om att man tvättar, man tvättar med TWEEN som är surfaktant för att få så mycket som möjligt ut
Lateral flow immunoassay
Lateral flow immunoassay
Absorbent pad
* Filter
* Drives flow – holds liquid
Anti-antigen Ab – (mobile)
* Labeled (colloidal Au, conjugated)
Anti-antigen Ab – (stationary)
* Test line
* Binds antigen (comp. sandwich ELISA)
Anti-conjugate Ab – (stationary)
* Binds mobile anti-antigen Ab
Absorbent platta: Samlar upp vätska man stoppar på
Sedan mobila antikroppar som kommer följa med vätksa, specifika mot det man vill veta är en detektionsantikroppar kopplad till guld partiklar
Membran som vätskan vandra på
Antikopp som ska binda till annat ställe på det proteinet vi är intresserade av.
Test trecket
Absoprbent pad (Smala överbliven vätska)
Lateral flow immunoassay
Sample (+buffer) application
Antigen har en gul del som binda till antikrpppar och grön del som binder till grön.
Lateral flow immunoassay
Mobile anti-antigen Ab binds stationary anti-antigen Ab
* Comp. Sandwich ELISA
* Positive result
Stationary anti-conjugated Ab binds mobile anti-antigen Ab (Fc)
* Control line
Remaining liquid is absorbed into the absorbent pad
När de kommer fram till stecket med test och konreol antikropp, gröna till gröna natikropp.hög konc. Av guldet.
Antikoppar är när många samlas på en strck synas det.
Kontroll antikropp binder till
Om man väntar länge kan det flöda tillbaka.
Not only covid and pregnancy tests
Potatis kan har virus och bondare köper tester för att känna till virus som kan förstöra hela skörden.
Absorbent platta: Samlar upp vätska man stoppar på
Sedan mobila antikroppar som kommer följa med vätksa, specifika mot det man vill veta är en detektionsantikroppar kopplad till guld partiklar
Membran som vätskan vandra på
Antikopp som ska binda till annat ställe på det proteinet vi är intresserade av.
Test trecket
Absoprbent pad (Smala överbliven vätska)
Sandwich ELISA liknar det.
Mycket antigen —> Negativ resultat.
Fördel: Billig och enkel.
Flow Cytometry
Flow Cytometry
Flow = Fluid
Cyto = Cell
Metry = Measurement
Particles/cells pass through a laser beam which causes a temporary disruption in the optics.
The size and nature of these disruptions enable the instrument to measure the particle’s size and granularity
Principen är att 2 delar
1- Celler i en smal stråle och man har ett flöde som smalar av och tvinggar celler att gå på rad och vi har en detektor där.
Laser
Forward och side scatter
Concept
* The light scatter is measured by two optical detectors
* One detector measures scatter along the path of the laser = forward scatter (FSC)
* One detector measures scatter at a 90-degree angle relative to the laser = side scatter (SSC).
→allow for some degree of cellular differentiation within a heterogeneous population
- Forward scatter allows discrimination of cells by size*
- FSC intensity is proportional to the diameter of the cell
- For example lymphocytes vs monocytes
- Side scatter allows discrimination of cells by complexity (i.e. granularity)*
- For example, monocytes and granulocytes. Granulocytes are characterized by a high volume of cytoplasmic granules
Man kan få info om cellerna:
Forward: Man mäter storlk på celler och avgöra lymfocyter ich
Plotta forwad och side, hamnar dem på olika ställen.
Varje punkt är en mätning av en cell, varje cell ger upphov till en punkt
Side: Visar hur granula den är och saker inuti.
Hur stora celler och hur kmplexa är de av forwad och side
Utöver FSC och SSC
* Kan också använda fluoroscerande antikroppar
* Vilka cellpopulationer uttrycker specifika markörer
Man kan märka in cellerna med antikoppar med flucers på för att undersöka dess epitoper.
Provet som går igenom smalt rör som bara kan gå en cell åt gången i laserstrålen och ljuset scatter och mätas upp av olika detektorer,
Forward: Mäta hur stor cellen är
Side: Mäta granula i cellen
Kan mäta olika flurocens i cellen, man får data för att separera storlek och granula på.
Om TNF-alfa, finns det inuti cellerna, måste vi gå intracellulärt
Fixerar med formaldehyd och lysisera cellen.
Först titta med antikroppar av celltyper
Sedan slå hål på cellen och sätta antikroppar på inuti cellen.
Den metoden är alltså bra för att känna till vilken cell vi har.
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS):
Flöde av celler genom en smal kanal
En blandning av celler i vätska rör sig genom en smal kanal, där de passerar en laser en i taget.
Laserexponering och fluorescensdetektion
När cellerna passerar genom lasern, avger de fluorescerande signaler (beroende på deras märkning).
En fotomultiplikator (photomultiplier tube) detekterar dessa signaler och skickar information till en dator.
Laddning och sortering av celler
Cellerna inkapslas i droppar.
En elektrisk laddning appliceras beroende på fluorescenssignalen:
Gröna celler får en positiv laddning.
Röda celler får en negativ laddning.
Icke-märkta celler och tomma droppar förblir neutrala.
Elektrostatisk avböjning och uppsamling
Elektriska plattor styr de laddade dropparna till olika uppsamlingsrör baserat på deras laddning.
Denna teknik gör det möjligt att separera specifika celltyper med hög precision för vidare analys eller användning.
