Prepareringstekniker för elektronmikroskopi

Question 1

Preparatkrav TEM

Answer 1

Question 2

Vävnadspreparering TEM

Answer 2

Fixering

Dehydrering

Inbäddning

Snittning

Kontrastering

Mikroskopering

Question 3

Fixerings typer?

Answer 3

Fysikalisk fixering ex. frysning (cryo), mikrovågsbehandling

Kemisk fixering:

Lämplig jonsammansättning

Lämplig osmolaritet

Förmåga att bibehålla konstant pH-värde

Question 4

Typer av kemisk fixering för TEM

Answer 4

**Dubbelfixering av små vävnadsbitar (ca 1 mm)

Primärfixering Formaldehyd, glutaraldehyd

Postfixering Osmiumtetroxid

Question 5

Inbäddning med härdplast, vilka krav?

Answer 5

Låg viskositet

Uniform polymerisering (härdning)

ingen volymförändring

Lämplig hårdhet

Stabil och jämn kvalitet

Question 6

Vad finns de för härdplaster och vad har de för för och nackdelar

Answer 6

Klistra in bild

Question 7

Vad snittar du med

Answer 7

Ultramikrotom

Glas- eller diamantkniv

Question 8

Kontrastisering, hur och varför

Answer 8

Varför? Öka effekten av den elastiska avlänkning

Hur? Grids med ultratunna snitt utsätts för lösningar av tungmetaller

Question 9

Svepelektronmikroskopi (SEM) används till?

Answer 9

Används för att titta på preparatets ytstruktur

Preparat upp till flera centimeters storlek

Question 10

Vad ska du tänka på vad gäller preparatet när du sk använda SEM

Answer 10

Preparatet måste vara torrt eftersom mikroskopet arbetar i högvakuum

Question 11

Preparatets yta beläggs ofta med ………för att öka den sekundära stålningen i SEM

Answer 11

Preparatets yta beläggs ofta med tungmetaller för att öka den sekundära stålningen

Question 12

Fixeringstyper för SEM

Answer 12

Primärfixering: aldehydfixering

Postfixering enl. OTOTO-metod = upprepad osmifiering

Question 13

Vad sker torkning med innan SEM?

Answer 13

Torkning: frystorkning

Question 14

Skillnader mellan TEM och SEM

Answer 14

Question 15

Immunocytokemi för TEM, vad ska du tänka på

Answer 15

antigen-epitoperna förstörs av traditionell TEM-preparering

• Kompromiss mellan att behålla antigeniciteten och god morfologi
• Krävs god planering för att bestämma metod

Question 16

Val av metod för immunocytokemi vad gäller TEM

Answer 16

*Pre-embedding

Immunoinkubering innan postfixering, dehydrering och inbäddning

*Post-embedding

Immunoinkubering görs på plast- inbäddade snitt (akrylatplast)

*Kryosnittning vid ca -100°C. Snitt inkuberas och inbäddas därefter i methylcellulosa

Question 17

Fixering – immunoTEM?

Answer 17

Kemisk fixering; Lägre koncentration och kortare tid

Frysning: utan att det bildas iskristaller

• Spegelfrysning, frysning mot en med flytande kväve (LN2) nedkyld kopparplatta
• Plunge-freezing, nedfrysning i flytande propan eller etan, kyld med LN2
• High pressure freezing (HPF), nedfrysning i LN2 med hjälp av högt tryck (ca 2000bar). Tempertursänkning i vävnaden med 15000 °C /sek

Question 18

PLT-metoden?

Answer 18

*Kemisk ”lättfixering”

Dehydrering med etanol under progressiv temperatursänkning

Inbäddning i akrylatplast

Polymerisering med UV-ljus

Snittning i rumstemperatur

Question 19

Detektering sker hur?

Answer 19

• Sker med hjälp av guldmärkta antikroppar.
• Dubbelinmärkning kan göras med olika storlekar på guldkornen