Immunologisk Metodik Flashcards
När använder man sig av immunohistokemi ?
•diagnos av immunologiska sjukdomar •diagnos-klassificera tunörer •påvisa mikroorganismer
Hur fungerar den immunologiska metoden ?
Analysmetoder som utnyttjar olika antikroppars specifika förmåga att fästa till olika epitoper (antigena determinanter) på ett antigen. Antikroppar fungerar som analytiska verktyg
Vad finns de för immunologiska metoder ?
•Immunohistokemi • Immunocytokemi • Immunoprecipitation • ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) • RIA (radioaktive immune assay) • Western blot, Northern blot, Southern blot • Dot blot, Slot blot • FACS
Vad gör ett antigen och vad är epitop?
Antigen = en för organismen främmande molekyl som framkallar en reaktion hos immunförsvaret. Denna reaktion leder till nybildning av antikroppar. Epitop (antigen determinant) = den del av ett antigen dit en specifik antikropp binder med en kort aminosyrasekvens (ca 6).
Ge exempel på antigener
Proteiner – proteinföreningar (Kolhydrater) (Lipider) Haptener (ex metall + protein)
Vad är en antikropp?
Ett glykoprotein som produceras i en organism vid antigenstimulering. • Har stor specificitet till det stimulerande antigenet
Vad finns de för antikropp klasser?
• Fem olika klasser: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM
Beskriv antikroppen
• Kedjorna är sammanlänkade med disulfidbindningar • Den yttre delen på båda kedjorna (Fab-domänen) är hypervariabla och bildar tillsammans ”antigen-binding site”
Vad är polyklonala antikroppar? Vad är monoklonala antikroppar?
Polyklonala antikroppar – Heterogen samling (flera olika antikroppar) riktade mot flera olika epitoper – Kan affinitetsrenas Monoklonala antikroppar -Identiska antikroppar riktade mot en epitop – ”Mest önskvärt” vid biokemiska tekniker
Vart bildas antikroppar?
B-celler (en typ av vit blodkropp) har membranbundna antikroppar bundna till sin yta 1. Främmande antigen träffar antikropp på B-cellen 2. B-cellen stimmuleras till delning samt tillverkning och utsöndring av fler antikroppar
Hur skiljer sig monoklonala och polyklonala antikroppar ifrån vara dra vad gäller bindning till epitop, och varför?
Polyklonala antikroppar: härstammar från flera cell-linjer – kan binda till flera olika epitoper Monoklonala antikroppar: härstammar från en enda cell-linje (klon), – kan binda till endast en typ av epitop
Hur binder antikroppar till antigenen? 3 sätt
• Antigen - antikroppsreaktion • Affinitet, aviditet • Specificitet, korsreaktion
Beskriv Antigen-antikroppsreaktion
Antikroppens ”binding site” känner igen en epitop på antigenet och binder sig dit med hjälp av: • Van der Waal´s krafter • Vätebindningar • Elektrostatiska interaktioner • Hydrofobiska krafter
Vad betyder affinitet resp aviditet?
Affinitet: styrkan i reaktionen mellan en antigen epitop och en antikropp Aviditet: sammanlagda styrkan mellan en antikropps bindningsställen och ett antigen
Beskriv specifitet-korsreaktion
Specificitet: en enskild antikropps förmåga att binda till endast en specifik antigen epitop Korsreaktion: en enskild antikropps förmåga att binda till fler än en antigen epitop
Vad är skillnaden på specifik och ospecifik inbindning?
Specifik inbindning: Bindning mellan Ak-Ag, till avsedd epitop Ospecifik inbindning: Bindning beror ej på Ak-Ag reaktion Exempel: • Endogent peroxidas/fosfatas • Endogent biotin • Autofluorescens • Komplementmedierad bindning
Endogena substanser är sådana som har sitt ursprung inifrån en organism, en vävnad eller en cell. Man kan exempelvis tala om Endogena kemikalier, när man talar om kemikalier som kroppen själv producerar. Vad finns de för endogena substanser, vart finns dem och hur inhiberas dessa?
• Endogent peroxidas Inhiberas med väteperoxidlösning (H2O2) Myeloida celler, hämoproteiner, myoglobin • Endogent biotin Inhiberas med avidin och biotinlösning Mitokondrier, lever, binjure, spottkörtel, karcinomer (bröst, colon
Vad finns de för Markörer på antikroppar (för detektion)
• Enzymer (ex. peroxidas, alk. fosfatas) • Fluorochromer (ex. rodamin, FITC) • Metaller (ex. guld, järn) • Isotoper
Vad finns de för immunologiska metoder?
• Immunohistokemi • Immunocytokemi • Immunoprecipitation • ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) • RIA (radioaktive immune assay) • Western blot, Northern blot, Southern blot • Dot blot, Slot blot • FACS
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), beskriv principen
Princip: Antigen binds till brunnarnas väggar. Prov tillsätts. Provets antikroppar reagerar med brunnarnas antigen.
Beskriv FACS Fluorescence activated cell sorting
• Celler i lösning märks med fluorescerande antikroppar (och får en laddning) • Cellerna passerar en laser – separation/sortering utifrån storlek och grumlighet • Fluorescensen mäts. Mängden ljus motsvarar mängd celler av en viss typ (olika celler sänder ut olika fluorescensmönster) • Cellerna passerar laddade plattor och sorteras utifrån sin laddning
När kan du få falskt positivt analyssvar
Antikroppen binder till fel eller flera olika epitoper (ev. blockera med normalserum) Förekomst av Ak-bindande endogen komponent (ev. blockera med H2O2)
När kan du få ett Falskt negativt analyssvar
•Prepareringen har förstört epitoperna • Maskerade epitoper (retrieval buffer) • Glömt antikropparna/svag ak-konc. • Paraffin kvar på snittet • Gamla lösningar
Beskriv negativ och positiv kontroll vid
Negativa kontroller: • Utelämna primärantikropp • Utelämna alla antikroppar Positiv kontroll: • Positiv testvävnad. Skall helst graderas, där endast en viss styrka på inmärkningen skall godkännas
Är de dem polyklonala eller de monoklonala antikropparna som kan affiniteternas?
polyklonala
Är polyklonala eller monoklonala antikroppar med önskvärda vid biokemiska analyser?
Monoklonala
Hur producerar du monoklonala resp polyklonala anikroppar?
Vilka typer av eliza finns de?
Hur delar du in de olika immunologiska metoderna och förklara dem
Vad finns de för indelningar inom indirekt metod, vad är skillnaden?
Vad betyder förkortningarna?
