Labbhandledning 1 Flashcards
Hur stora får vävnadsbitar vara?
15 x 15 x 4 mm för paraffininbäddning
Vad skall beaktas vid utskärning?
patologiska förändringar, randområden mellan patologiska förändringar och normal vävnad, samt längdsnitt och tvärsnitt.
Vad är dehydrering och vad sker?
Avlägsnande av vävnadens innehåll av vatten. Ett inert ämne infiltrerar vävnaden (t.ex. paraffin). Detta infiltreringsmedium hårdnar efter infiltreringen och stabiliserar vävnaden.
Hur går du till väga vid sittning?
De inbäddade vävnaderna snittas de i 2-5 μm tunna skivor mha mikrotom, sträcks först i kallt vattenbad och sen i varmt vattenbad och fångas upp på objektglas.
När används nedfrysning och frysnitt av vävnad?
Snabbdiagnostik och vid känslig vävnad
Hur gör du vid nedfrysning och fryssnittning?
Vävnaden fryses ned av flytande kväve. Den frusna vävnadsbiten monteras fast på en korkplatta med hjälp av ”tragakant” eller OCT-gel och snittas sedan i fruset tillstånd i en kryostat (ca – 200). Snitt-tjocklek ca 4-6 μm. Snitten fångas upp på rumstempererat plusmärkt-objektglas. Låt lufttorka.
Vad är viktigt att tänka på vid färska prov?
Smitta
Berätta om Mayers Hematoxylins betmedel
Mayers hämatoxylin, ett basiskt metallkomplexfärgämne (betmedel = aluminium).
Vad menas med: deparaffinering rehydrering dehydrering
Deparaffinering: Paraffinet avlägsnas mha xylen.Färgmolekylerna kan då tränga in i vävnad. Rehydrering: Vatten återförs till vävnaden (sjukande konc av alkohol) Dehydrering: vatten avlägsnas med hjälp av stigande konc. av alkohol innan montering
När sker visualisering/färgning?
efter rehydrering
MAYERS HÄMATOXYLIN-EOSIN, berätta
Hematoxylinet är basiskt och färgar negativt laddade nukleinsyror (kärnor och ribosomer) blå. Eosin är en sur färgsubstans som färgar proteiner rosa eller röd. Kärnor – blå Erytrocyter och eosinofila granula – rosa till röda Cytoplasma – varierande nyanser av rosa Muskelfibrer – djupt rosaröda
GROKOTT, principen?
Polysackarider oxideras till aldehyder. Silvernitrat reduceras till metalliskt silver.
Felkällor vid grocott?
Silverlösningen filtreras och förvärms.
Föroreningar kan orsaka störande fällningar på snittet. Använd rena utensilier, rent vatten, rena kemikalier och plastpincett.
Ofärgat snitt: glömt chromsyra
Inget silver: glömt natriumtiosulfat som gör att silvret kan fastna på snittet
Hur färgar grocott?
Svamp och protozoer – mörkbruna Bakgrund - grön
VISUALISERING IMMUNOHISTOKEMI abc metoden, berätta
Specifikt riktade antikroppar användes ofta vid tumördiagnostik. PSA-antikroppar riktade mot prostataspecifikt antigen påvisar om metastas, i annat organ, har sitt ursprung från prostatatumör. ABC– metoden är en indirekt metod (3 på varandra följande steg). Steg 1: Primär antikropp fäster på sökt antigen. Steg 2: Biotinylerad sekundär antikropp fäster till den primära antikroppen. Steg 3: Peroxidaskonjungerat ABC-komplex fäster till biotinet på den sekundära antikroppen. Tillsats av kromogen-substratlösning som reagerar med peroxidaset skapar en färgad produkt.
Resultat av ABC-metoden för PSA
Prostataspecifikt antigen – brunt Kärnor – blå
Beskriv hur du monterar
Glasen monteras från xylen. En liten sträng Mountex monteringsmedel (plastbaserat) anbringas på objektglaset/täckglaset. Täckglaset lägges på objektglaset Tryck försiktigt bort eventuella luftblåsor Torka bort överflödigt monteringsmede
Vad ska du göra om du upptäcker fel vid immunohistokemi färgning?
Gå tillbaka och titta på vad som kan ha blivit fel, provar mig fram
Vad kan ha hänt om du får ett falskt positivt svar, dvs både negativ och positiv kontroll samt patient prov är positivt?
Kan ej lita på detta. De kan bero på: • lagt primär antikropp på negativt kontroll glas • ingen blockad mot endogent peroxidas
Vad kan ha hänt om du får ett falskt negativt svar, dvs både negativ och positiv kontroll samt patient prov är negativt?
•första antikroppen har ej bundit •fel specis •gömda epitoper pga gelers de fixmedel •sekundär antikropp fel specis
Varför stannar du ibland i destvatten och ibland i alkohol vid deparaffinering?
Skall jag arbeta med dest efteråt tar jag dest och ska jag använda alkohol i steget efter stannar jag i alkohol
Vad gör unmasking med retrieval buffert?
Bryter metylenbryggor från generande fix-medel
Vad gör peroxidas blockad?
Blockerar endogent peroxidas så att antikropparna inte kan färga in detta
Varför blånar man?
För att få en intensivare färgning på kärnorna, det sker en pH förändring. Från rödaktigt -> blått
Förklara grocott färgningen
För att åstadkomma visualisering måste först kolhydraterna oxideras, vilket görs med hjälp av kromsyran. Oxidationen gör att aldehydgrupper bildas.
De kromsyramolekyler som ej förbrukas vid oxidationen, neutraliseras med natriumbisulfit.
Aldehydgrupperna reducerar silvernitratet till metallisksilver.
För att främja reaktionen används metanamin som ger en alkalisk miljö för den att ske i, där bufferten i reaktionen heter Borax.
För att silvermolekylerna ska fästa på vävnaden fixeras den med natriumtiosulfat.
För att vidare få en stabilare färgning tillsätts guldklorid då den är stabilare i jämförelse med silver. Guldkloriden ersätter silvermolekylerna med metalliskguld och gör att snitten bevaras längre samt bleker vävnaden och gör att kontrasten i snittet blir bättre.
För att öka kontrasten ytterligare, samt för att lättare kunna orientera sig i preparatet, färgas det in med light green som ger en bakgrundsinfärgning som skiljer sig från den svarta svampinfärgningen.
Hur länge skall snitten brännas i ugn? I hur många grader?
De bränns därefter fast på objektglaset vid c:a 600C under 15–30 minuter.
Hur tjocka snitt vid fryssnittning resp paraffinsnittning?
Frys; 4-6 um
Paraffin; 2-5 um
Du sitter och monterar, din montering blir bra, du ser inga luftbubblor. När du sedan kommer tillbaka ser du att de kommit luftbubblor under tiden du varit borta. Vad kan detta bero på?
Detta kan bero på att mitt snitt är tjockt och att jag använt för lite lim
