Labbhandledning 1

Question 1

Hur stora får vävnadsbitar vara?

Answer 1

15 x 15 x 4 mm för paraffininbäddning

Question 2

Vad skall beaktas vid utskärning?

Answer 2

patologiska förändringar, randområden mellan patologiska förändringar och normal vävnad, samt längdsnitt och tvärsnitt.

Question 3

Vad är dehydrering och vad sker?

Answer 3

Avlägsnande av vävnadens innehåll av vatten. Ett inert ämne infiltrerar vävnaden (t.ex. paraffin). Detta infiltreringsmedium hårdnar efter infiltreringen och stabiliserar vävnaden.

Question 4

Hur går du till väga vid sittning?

Answer 4

De inbäddade vävnaderna snittas de i 2-5 μm tunna skivor mha mikrotom, sträcks först i kallt vattenbad och sen i varmt vattenbad och fångas upp på objektglas.

Question 5

När används nedfrysning och frysnitt av vävnad?

Answer 5

Snabbdiagnostik och vid känslig vävnad

Question 6

Hur gör du vid nedfrysning och fryssnittning?

Answer 6

Vävnaden fryses ned av flytande kväve. Den frusna vävnadsbiten monteras fast på en korkplatta med hjälp av ”tragakant” eller OCT-gel och snittas sedan i fruset tillstånd i en kryostat (ca – 200). Snitt-tjocklek ca 4-6 μm. Snitten fångas upp på rumstempererat plusmärkt-objektglas. Låt lufttorka.

Question 7

Vad är viktigt att tänka på vid färska prov?

Answer 7

Smitta

Question 8

Berätta om Mayers Hematoxylins betmedel

Answer 8

Mayers hämatoxylin, ett basiskt metallkomplexfärgämne (betmedel = aluminium).

Question 9

Vad menas med: deparaffinering rehydrering dehydrering

Answer 9

Deparaffinering: Paraffinet avlägsnas mha xylen.Färgmolekylerna kan då tränga in i vävnad. Rehydrering: Vatten återförs till vävnaden (sjukande konc av alkohol) Dehydrering: vatten avlägsnas med hjälp av stigande konc. av alkohol innan montering

Question 10

När sker visualisering/färgning?

Answer 10

efter rehydrering

Question 11

MAYERS HÄMATOXYLIN-EOSIN, berätta

Answer 11

Hematoxylinet är basiskt och färgar negativt laddade nukleinsyror (kärnor och ribosomer) blå. Eosin är en sur färgsubstans som färgar proteiner rosa eller röd. Kärnor – blå Erytrocyter och eosinofila granula – rosa till röda Cytoplasma – varierande nyanser av rosa Muskelfibrer – djupt rosaröda

Question 12

GROKOTT, principen?

Answer 12

Polysackarider oxideras till aldehyder. Silvernitrat reduceras till metalliskt silver.

Question 13

Felkällor vid grocott?

Answer 13

Silverlösningen filtreras och förvärms.

Föroreningar kan orsaka störande fällningar på snittet. Använd rena utensilier, rent vatten, rena kemikalier och plastpincett.

Ofärgat snitt: glömt chromsyra

Inget silver: glömt natriumtiosulfat som gör att silvret kan fastna på snittet

Question 14

Hur färgar grocott?

Answer 14

Svamp och protozoer – mörkbruna Bakgrund - grön

Question 15

VISUALISERING IMMUNOHISTOKEMI abc metoden, berätta

Answer 15

Specifikt riktade antikroppar användes ofta vid tumördiagnostik. PSA-antikroppar riktade mot prostataspecifikt antigen påvisar om metastas, i annat organ, har sitt ursprung från prostatatumör. ABC– metoden är en indirekt metod (3 på varandra följande steg). Steg 1: Primär antikropp fäster på sökt antigen. Steg 2: Biotinylerad sekundär antikropp fäster till den primära antikroppen. Steg 3: Peroxidaskonjungerat ABC-komplex fäster till biotinet på den sekundära antikroppen. Tillsats av kromogen-substratlösning som reagerar med peroxidaset skapar en färgad produkt.

Question 16

Resultat av ABC-metoden för PSA

Answer 16

Prostataspecifikt antigen – brunt Kärnor – blå

Question 17

Beskriv hur du monterar

Answer 17

Glasen monteras från xylen. En liten sträng Mountex monteringsmedel (plastbaserat) anbringas på objektglaset/täckglaset. Täckglaset lägges på objektglaset Tryck försiktigt bort eventuella luftblåsor Torka bort överflödigt monteringsmede

Question 18

Vad ska du göra om du upptäcker fel vid immunohistokemi färgning?

Answer 18

Gå tillbaka och titta på vad som kan ha blivit fel, provar mig fram

Question 19

Vad kan ha hänt om du får ett falskt positivt svar, dvs både negativ och positiv kontroll samt patient prov är positivt?

Answer 19

Kan ej lita på detta. De kan bero på: • lagt primär antikropp på negativt kontroll glas • ingen blockad mot endogent peroxidas

Question 20

Vad kan ha hänt om du får ett falskt negativt svar, dvs både negativ och positiv kontroll samt patient prov är negativt?

Answer 20

•första antikroppen har ej bundit •fel specis •gömda epitoper pga gelers de fixmedel •sekundär antikropp fel specis

Question 21

Varför stannar du ibland i destvatten och ibland i alkohol vid deparaffinering?

Answer 21

Skall jag arbeta med dest efteråt tar jag dest och ska jag använda alkohol i steget efter stannar jag i alkohol

Question 22

Vad gör unmasking med retrieval buffert?

Answer 22

Bryter metylenbryggor från generande fix-medel

Question 23

Vad gör peroxidas blockad?

Answer 23

Blockerar endogent peroxidas så att antikropparna inte kan färga in detta

Question 24

Varför blånar man?

Answer 24

För att få en intensivare färgning på kärnorna, det sker en pH förändring. Från rödaktigt -> blått

Question 25

Förklara grocott färgningen

Answer 25

För att åstadkomma visualisering måste först kolhydraterna oxideras, vilket görs med hjälp av kromsyran. Oxidationen gör att aldehydgrupper bildas.

De kromsyramolekyler som ej förbrukas vid oxidationen, neutraliseras med natriumbisulfit.

Aldehydgrupperna reducerar silvernitratet till metallisksilver.

För att främja reaktionen används metanamin som ger en alkalisk miljö för den att ske i, där bufferten i reaktionen heter Borax.

För att silvermolekylerna ska fästa på vävnaden fixeras den med natriumtiosulfat.

För att vidare få en stabilare färgning tillsätts guldklorid då den är stabilare i jämförelse med silver. Guldkloriden ersätter silvermolekylerna med metalliskguld och gör att snitten bevaras längre samt bleker vävnaden och gör att kontrasten i snittet blir bättre.

För att öka kontrasten ytterligare, samt för att lättare kunna orientera sig i preparatet, färgas det in med light green som ger en bakgrundsinfärgning som skiljer sig från den svarta svampinfärgningen.

Question 26

Hur länge skall snitten brännas i ugn? I hur många grader?

Answer 26

De bränns därefter fast på objektglaset vid c:a 600C under 15–30 minuter.

Question 27

Hur tjocka snitt vid fryssnittning resp paraffinsnittning?

Answer 27

Frys; 4-6 um

Paraffin; 2-5 um

Question 28

Du sitter och monterar, din montering blir bra, du ser inga luftbubblor. När du sedan kommer tillbaka ser du att de kommit luftbubblor under tiden du varit borta. Vad kan detta bero på?

Answer 28

Detta kan bero på att mitt snitt är tjockt och att jag använt för lite lim