Kryostatsnittning

Question 1

Inre och yttre faktorer påverkar vävnaderna genast efter det att de har avlägsnats ur kroppen vid individens död. Postmortala förändringar förorsakas framförallt genom;

Answer 1

• Autolys dvs enzymernas vävnadsupplösning • Därefter tränger bakterier in i preparatet och förstör – vävnaden ruttnar • Om preparaten ligger i rumstemp, så torkar de och ändrar färg och form

Question 2

Omedelbara åtgärder som stoppar dessa förstörelseprocesser och bevarar – fixerar – preparatets naturliga utseende i den mån det är möjligt, är således nödvändigt. Nämn de omedelbara åtgärderna och vad dessa åtgärder leder till.

Answer 2

• Fixering är avstannande av livsprocessen med minsta möjliga förändring av cellerna. • Vävnad för nedfrysning ska fixeras eller fryses ned så fort som möjligt efter utskärning av vävnaden från kroppens blodförsörjning, för att undvika morfologiska förändringar och nedbrytningar.

Question 3

Det finns olika köldblandningar att använda för nedfrysning. Vilka är dem och vad blir morfologi resultatet?

Answer 3

• Torris (fast CO2) & isopentan = normal morfologi
• Flytande kväve = bra morfologi
• Flytande kväve /gasol = utmärkt morfologi

Question 4

Varför ska man inte vänta med nedfrysning utan göra en snabb och direkt nedfrysning?

Answer 4

• Mycket snabb nedfrysning av materialet, gör att små iskristaller bildas av vattnet som finns i vävnaden • Och därmed bildas mindre eller inga artefakter alls och ingen skada sker på vävnaden

Question 5

Vad kan en för långsam nedfrysning av preparat leda till?

Answer 5

För långsam nedfrysning kan orsaka en vävnads förändring pga iskristall-bildningen. Detta kan ersätta den riktiga vävnads- arkitekturen med en s.k. ”schweizerost”- effekt, dvs det bildas ”hål” i vävnaden. Detta kan då leda till att förändring missas!

Question 6

Det finns olika metoder som används vid nedfrysning beroende på vad de är man skall frysa ned. Berätta om de tre främsta metoderna.

Answer 6

• Nedfrysning av färsk vävnad som innehåller enzymer - används ofta för färsk muskelvävnad. Muskelvävnaden stöds och skyddas med Tragacant, som är ett inert stödmedium, och snabb fryses med flytande kväve eller flytande kväve/gasol.
• Nedfrysning av färsk vävnad– Vävnaden bäddas in i OCT och snabb fryses med flytande kväve eller med torris&isopentan.
• 4% PFA fixerad vävnad, Vävnaden bäddas in i OCT och kan frysas ned med flytande kväve eller torris&isopentan.

Question 7

Frysklister OCT Cryomount, berätta om detta samt dess fördelar

Answer 7

•Användningsområde: Inbäddningsmedium för fryssnittning vid temperaturer från -10°C och lägre. OCT Cryomount ska omge vävnadsprovet vid infrysning för att ge optimalt stöd och stabilitet vid kryostatsnittning. • Fördelar: Lättlösligt i vatten och försvinner helt under efterbehandling och efterföljande färgning, vilket eliminerar oönskad bakgrundsfärgning. • (OCT = Optimal Cutting Temperature)

Question 8

Berätta om flytande kväve

Answer 8

• Flytande kväve är en färglös, luktlös och smaklös vätska. • Gasen är inte giftig och brinner inte. • Kokpunkten är -196oC vid atmosfärstryck. • Varningsskylt märkt ”Flytande kväve” ska anslås på lokal där flytande kväve förvaras/hanteras.

Question 9

Berätta om olycksfallsrisker med flytande kväve och handlingsplan kring detta.

Answer 9

• Vid förångning av flytande kväve finns risk för undanträngning av luftens syre. Detta kan medföra syrebrist vilket i sin tur kan leda till kvävning. Skulle en person få andningsbesvär skall läkare tillkallas samtidigt som personen skall flyttas ut i frisk luft och hållas varm och stilla. (Tänk på att 1 L flytande kväve blir 1 m3 gas) •risk för köldskador finns. Förfrusen kroppsdel skall hållas under ljummet vatten tills känsel och färg återkommer. Uppsök läkare vid omfattade köldskador och vid stänk i ögon skall ögonen sköljas rikligt i 15 min och läkare skall kontaktas.

Question 10

Hur skall du hantera flytande kväve?

Answer 10

• Vid små spill skall man lämna lokalen och bedöma om ytterligare åtgärder behöver vidtas. • Vid stora utsläpp skall området stängas av. Sanering sker genom att ventilera. • Undvik att åka hiss med behållare med flytande kväve. • Flytande kväve får ej hällas i vask. • Endast kärl som är avsedda för flytande kväve får användas. Mindre kärl placeras sen i dragskåp där kvävet riskfritt kan dunsta bort efter användningen. • Sörj för god ventilation • Arbeta aldrig ensam i rummet • Installera larm som anger låg syrehalt, eller ha dörren öppen • Använd knäppt labrock • Använd skyddshandskar, heltäckande skor, ögonskydd som skyddsglasögon eller visir

Question 11

Vad skall du göra om du skall förvara ett nedfryst prov?

Answer 11

Svep snabbt in provet i märkt folie, och lägg i ett Dewarkärl med flytande kväve, eller vid långtidsförvaring i -80 oC frys

Question 12

Vad skall du göra innan du börjar snitta på kryostat?

Answer 12

• Avlägsna det frusna blocket från -80 C frys och låt det temperatur utjämnas i kryostat kammaren vid ung. -20 C. • Den optimala temperaturen för kryostat snittning beror på vilken typ av vävnad det är och om vävnaden nyligen frysts ner färsk eller varit pre-fixerad, med efterföljande kryoskydd av OCT eller Tragakant.

Question 13

Hur fungerar kryostatsnittningen/omhändertagandet att frysta prov

Answer 13

• Kryostat snitten fångas upp på rumstempererade objektsglas. • Låt snitten luftfixeras – lufttorka • Färga snitten, montera • Eller post-fixera i etanol/metanol eller aceton, vilket är en rutinmetod immunhistokemisk analys mha antikroppar.