PCR, Sanger, qPCR e NGS- Aula Flashcards
O que é e quais são as etapas do PCR? Qual sua importância e limitação?
Reação que replica inúmeras vezes um trecho de DNA-
*primers delimitam início/fim sequência de interesse.
Desnaturação (aumento temp = abre fitas)
Anelamento (primers delimitam trecho que DNA polimerase irá se ligar)
Extensão: replicação por DNA polimerase resistente ao calor
*ocorrem de forma cíclica ; (olhar cards tbl)
Amplifica trecho DNA X Tamanho máximo 5kb
O que é a eletroforese em gel ?
-imersão de um gel em um tampão eletrolítico,
aplica corrente elétrica nesta cuba.
-DNA aplicado na extremidade do gel orientada p/ polo negativo do campo elétrico-> moléculas migra sentido do polo positivo.
-As moléculas menores passam + rapidamente pelos
poros do gel-> migram distâncias maiores.
*vê diferentes tamanhos de DNA na amostra (molde de apoio c/ tamanho conhecido p/ comaparar)
O que é o sequenciamento Sanger? Quais suas aplicações e limitações?
Mesmo principio PCR; 1º faz PCR p/ amplificar DNA e depois realiza um 2º diferentes, pois:
-Usa 1 primer; nucleotídeos normais e fluorescentes (impede que proxima base se ligue)
-Gera sequencias de tamanhos diferentes-> aplicam em eletroforense capilar que lê fluorescência dos diferentes tamanhos e identifica base (fragmentos menores migram mais rápido- identifica fluorescência ultima base)
Buscar mutação quando região genômica é conhecida
*sequencia apenas 1kb
O que é o sequenciamento qPCR? Quais suas aplicações e limitações?
PCR c/ fluoresecnia e primer, porém mede quantidade fluorescência a cada ciclo
Começa c/ trancricao reversa RNA p/ DNA (usa primer cauda poli A do RNA ou degenerado)
Baseada na quantidade de produto PCR produzido a cada reação
CT amostra: nº ciclo em que linha cruza thereshold (quanto menor o CT- maior a quantidade de amostra inicial; CT inversamente proporcional)- permite identificar quant alvo inicialmente presente
Pode ser utilizado para mensurar: número de cópias, expressão gênica ou genotipagem
Qual tipo de investigação o PCR, Sanger e qPCR permitem?
PCR: base técnicas biologia molecular
*Eletroforese: indt fragmentos DNA por tamanho- verifica se PCR funcionou
Sanger: idnt região de interesse
qPCR: mensura quant material genético em amostra- expressão genica// deleções + duplicações DNA- alvo único
Pra que serve o NGS? Quais suas etapas?
Sequenciar vários trechos diferente de DNA em paralelo
Preparação de Biblioteca: fragmentação DNA; amplificação; ligação de adaptadores para primers universais e hibridização
Sequenciamento: hibridização fragmentos; leitura nucleotídeos (fluorescentes; depois retira)
Annalise dados: análise sobreposição; alinhamento -> chamada variantes -> análise dados
-chamada variantes: compara sequencia com genoma referencia p/ verificar mutação
-cobertura: quantas vezes base foi sequenciada (mais vezes = + acurácia)
O que são reads, adaptadores, biblioteca e alinhamento?
Read: série única de nucleotídeos representando a sequência fragmento original
Adaptador: Sequências acopladas na extremidade do DNA fragmentado (permite hibridizacão, orienta primer)
Biblioteca: coleção de fragmentos de DNA com adaptadores ligados nas extremidade
Alinhamento: Mapeamento de uma sequência lida em um genoma de referência conhecido.
Quais são os outros tipos de sequenciamento NGS?
Exoma: de exons, reads iguais (sequencia tudo no genoma, até o que não é expresso)
Paíneis: sequenciamento especifico de alguns genes
Transcriptoma: de DNA que veio de transcriptase reversa de RNA; reads mais ou menos de acordo c/ intensidade expressão (apenas aquilo que é expresso)
No que consiste as técnicas de Cariótipo, FISH e Microarray?
Cariótipo: visualização cromossomos em metástase- bandas claras/ escuras de acordo c/ conteúdo AT//CG; vê perda/ ganho trecho DNA ou alterações estruturais (inversões/ translocações)
FISH: usa sonda c/ fluorescencia- se liga a região homologa (complementariedade bases)= emite fluorescencia; idnt ganho/ perda material genético e mapeamento pontos inversão/ translocação
Microarray: hibridização fragmentos DNA fluorescentes- se ligam a sondas conhecidas (seu trecho representa parte genoma)- fluorescência local spot que se ligam indica presença ou ausência do DNA na amostra
Para que se usa o Microarray? Quais as principais diferenças entre Cariótipo, FISH e Microarray?
Quantificar expressão genica; investigar CNV (array CGH- deleções/ duplicações) e genotipar SNP (MA Sde SNP- identifica CNV tbm, dissomias uniparentais + quantificação expressão genica)
Cariotippo e FISH mostram alterações estruturais
Microarray permite ver CNVs menores (tem melhor resolução que FISH e Cariótipo)
