PCR + Sanger + qPCR Flashcards
O é tecnologia recombinante e o que ela permite? Em quais técnicas ela consiste?
Habilidade de manipular DNA com precisão em tubo de ensaio ou organismo
-isolar qualquer gene individual
- produzir produto gênico introduzindo o gene em cell de animais ou bactérias
-clivagem DNA (nuclases de restrição), ligação de DNA, clonagem de DNA, hibridização de ácidos nucleícos, síntese de DNA e determinacacaio sequencia nucleotídeos de cadeia DNA
O que é e como ocorre uma reação de PCR- suas três etapas?
Ferramente que identifica sequencia DNA e faz copias dela continuamente
Desnaturação- separa bases complementares (DNA template é aquecido e separa bases)-92º
Anelamento- especifica região a ser copiada (primer foward- começo região e reverse- final)- 64º
Extensão- copia DNA (Taq DNA polimerase acha primer e faz complementação de bases sentido 5-3 usando dNTPs)- 72º
*reações ocorrem no thermalcycler e podem variar de temperatura e tempo (diminui a cada ciclo)
Qual a finalidade do PCR e quais os reagentes envolvidos?
Amplificar DNA (reação de cadeia polimerase) p/ achar sequencia especifica-> pode fazer produção , sequenciamento etc
*cerca 30 ciclos = bilhões copias
DNA template + primer (específicos); Taq polimerase (resistente a calor) dNTPs (nucleotídeos dispersos) + buffer (tampão com pH optimizado + ions magnesium )
*varios ciclos sao necessarios para achar produto PCR desejado
Como ocorre a separação de DNA por eletroforese em gel ?
Dentro caixa em gel (agarose, c/ câmera tampão que permite condução elétrica da fonte p/ moléculas):
-DNA é colocado em campos elétrico com carga negativa e positiva
-DNA tem carga negativa, então move-se para lado positivo do campo, pedaços menores se movem nos poros de agarose
-deslocamento difere por tamanho (tamanhos distintos permite diferenciar moléculas na eletroforese por seu deslocamento nos poços de agarose)
-marcador de DNA conhecido é utilizado para estimar tamanhos
*fonte de alimentação faz corrente elétrica que permite circulação moléculas na matriz do gel
*corante adicionado a agarose permite visualizar DNA + luz UV
