MP ulepszanie mikroorganizmów

Question 1

Kiedy opłaca się ulepszać drobnoustrój do celów przemysłowych?

Answer 1

Jeśli nakład nie przekracza 3 letnich oszczędności/dochodów

Question 2

Rodzaje zabiegów stosowanych do ulepszania drobnoustrojów

Answer 2

Zmiana warunków hodowli i zmiany genetyczne

Question 3

Modyfikacje enzymów anabolicznych i katabolicznych w kierunku nadprodukcji

Answer 3

Enzymy anaboliczne (biosyntezy): brak produkcji lub brak rozpoznania represora, enzym kontrolujący asymilację składnika wydzielany poza komórkę; Enzymy kataboliczne (rozkładu): enzym indukcyjny zmieniony na konstytutywny (niezależny od substratu), enzym aktywny w obecności represora (niewrażliwy na sprzężenie zwrotne), odporność na represję kataboliczną

Question 4

Na jakim etapie ma miejsce regulacja syntezy enzymów u mikroorganizmów?

Answer 4

Na poziomie inicjacji translacji

Question 5

Na czym polega kontrola pozytywna i negatywna transkrypcji?

Answer 5

Pozytywna – związanie aktywatora/induktora przed operatorem promotorem; Negatywna – związanie represora w obrębie operatora/za promotorem

Question 6

Operon laktozowy – kontrola pozytywna czy negatywna? Jak działa?

Answer 6

Kontrola negatywna – w obecności allolaktozy (induktora) represor nie może wiązać induktora

Question 7

Czy IPTG jest substratem β-galaktozydazy? Czy wiąże się do represora? Do czego służy?

Answer 7

Nie jest substratem β-galaktozydazy. Wiąże się do represora i go inaktywuje. Służy do indukcji operonu laktozowego w hodowli.

Question 8

Czy X-Gal jest substratem β-galaktozydazy? Czy wiąże się do represora? Do czego służy?

Answer 8

Jest substratem β-galaktozydazy. Nie wiąże represora. Służy do selekcji mutantów konstytutywnych β-galaktozydazy.

Question 9

Operon maltozowy – kontrola pozytywna czy negatywna? Jak działa?

Answer 9

Aktywator bez maltozy (induktor) nie wiąże się do operatora. Po dodaniu maltozy wiąże się i rekrutuje polimerazę do promotora.

Question 10

Czym jest efekt glukozowy?

Answer 10

Gdy w pożywce obecna jest glukoza i np. laktoza, to bakterie ignorują laktozę (operon lac nie jest aktywowany mimo obecności induktora).

Question 11

Czym jest represja kataboliczna?

Answer 11

Mechanizm regulacji polegający na zahamowaniu ekspresji genów niektórych szlaków biochemicznych w obecności preferowanego źródła energii.

Question 12

Co jest sygnałem „głodu” glukozowego? Co powoduje?

Answer 12

Pojawienie się cAMP. Powoduje zatrzymanie represji katabolicznej i umożliwienie działania np. operonu lac w obecności laktozy.

Question 13

Diauksja

Answer 13

Wzrost dwufazowy – gdy w pożywce obecne są dwa źródła węgla (np. glukoza i laktoza) to najpierw zużyte zostanie źródło preferowane (glukoza), potem nastąpi faza przystosowania (lag) i po czasie zacznie być zużywane drugie źródło węgla.

Question 14

W jaki sposób selekcjonuje się mutanty „enzym indukowany → konstytutywny”?

Answer 14

Sekwencyjna hodowla na zmianę na podłożach z induktorem i bez (przerośnięcie komórek niezmutowanych przez konstytutywne mutanty); Hodowla na podłożu ze źródłem węgla będącym słabym induktorem ale dobrym substratem; Hodowla w chemostacie – induktor czynnikiem ograniczającym wzrost z innymi składnikami w nadmiarze, stężenie induktora poniżej potrzebnego do indukcji (przewaga selekcyjna mutantów)

Question 15

Selekcja bakterii Bacillus z proteazami niezależnymi od obecności aminokwasów

Answer 15

Izolacja szczepów zdolnych do sporulacji w obecności aminokwasów (normalnie hamują proteazy i sporulację)

Question 16

Selekcja uniezależnienia od represji katabolicznej

Answer 16

Selekcja rewertantów wśród szczepów niezdolnych do produkcji danego enzymu – możliwa rewersja na drodze niezależnej od represji katabolicznej

Question 17

Czym są izoenzymy?

Answer 17

Izoenzymy katalizują tą samą reakcję, ale mają odmienne właściwości biochemiczne (np. inne optimum pH) i inne sposoby kontroli aktywności

Question 18

Sterowanie metabolizmem przez regulację szlakami metabolicznymi

Answer 18

Zablokowanie syntezy represora (produktu końcowego), zablokowanie niepożądanych ścieżek szlaku („rozgałęzień”, np. przez nadmiar produktu tego odgałęzienia), eliminacja pierwiastków śladowych z podłoża, zmiana pH, sterowanie stężeniem czynnika limitującego,

Question 19

Sposoby uzyskania nadprodukcji (podsumowanie)

Answer 19

zwiększenie syntezy enzymu, zamknięcie „rozgałęzień” szlaku, uwolnienie od regulacji (sprzężenia zwrotnego ujemnego), przekierowanie innych ścieżek metabolicznych (np. rozkład glukozy przez szlak pentozofosforanowy zamiast przez glikolizę), zmniejszenie innych szlaków do minimum, eksport produktu na zewnątrz (obniżenie lokalnego stężenia i zmniejszenie działania sprzężenia zwrotnego + łatwiejsze oczyszczanie)

Question 20

Mutanty selekcyjne i nieselekcyjne

Answer 20

Mutanty selekcyjne wybieramy pod względem danej cechy (np. kolonia wyrosła w obecności antybiotyku – mutant odporny na antybiotyk); Mutanty nieselekcyjne wymagają więcej pracy – mutanty odróżniają się widoczną cechą od typu dzikiego, ale jego właściwości wymagają sprawdzenia na drodze screeningu

Question 21

Selekcja pozytywna i negatywna

Answer 21

Pozytywna: skierowana na mutanta; Negatywna: skierowana przeciw szczepowi rodzicielskiemu

Question 22

Selekcja penicylinowa

Answer 22

Penicylina zabija jedynie rosnące komórki. Mutanty auksotroficzne na pożywce bez czynnika wzrostowego nie rosną, wild type rosną ale są zabijane przez penicylinę. Po odpłukaniu penicyliny na medium z czynnikiem wzrostowym rosną mutanty (i niedobitki WT ewentualnie)

Question 23

Naturalna rekombinacja

Answer 23

Przekazanie materiału genetycznego z komórki dawcy do biorcy w wyniku fizycznego kontaktu komórek na drodze wymiany homologicznych fragmentów DNA dawcy i biorcy. Pozwala na „nieprzyczepienie plakietki GMO”.

Question 24

Cel naturalnej rekombinacji

Answer 24

Pozyskanie nowego materiału genetycznego i użycie go do wzbogacenia genotypów szczepów produkcyjnych

Question 25

Sposoby naturalnej rekombinacji u grzybów

Answer 25

Fuzja grzybni in vivo (cykl paraseksualny) lub fuzja protoplastów in vitro (krzyżówki wegetatywne)

Question 26

Naturalna rekombinacja u bakterii

Answer 26

Transformacja, koniugacja, transdukcja, transpozony, rekombinacja

Question 27

Mutageneza ukierunkowana

Answer 27

Wprowadzenie losowych zmian w danym genie i selekcja mutantów o danych cechach. Wymaga znajomości sekwencji genu/genomu.

Question 28

Inżynieria metaboliczna

Answer 28

Bezpośredni wpływ na daną cechę przez modyfikacje konkretnych reakcji biochemicznych z użyciem technologii rekombinowanego DNA. Składa się z części analitycznej i syntezy.

Question 29

Źródła nowych enzymów

Answer 29

organizmy VBNC, zsekwencjonowane genomy, organizmy ekstremofilne

Question 30

Tasowanie genomów

Answer 30

Selekcja szczepów o ulepszonych cechach, rekombinacja między nimi i znowu selekcja itd. – umożliwia szybką kombinację użytecznych mutacji

Question 31

Heterologiczna ekspresja białek – problemy

Answer 31

Niestabilność produktów, nieprawidłowe fałdowanie, trudności z modyfikacjami potranslacyjnymi

Question 32

Gospodarze prokariotyczni

Answer 32

E. coli (g-), B. subtilis (g+), Lactococcus lactis (g+), Bacillus megaterium (g+), Staphylococcus carnosus (g+), Burkholderia sp (g-), Rhodobacter sp (g-)

Question 33

Gospodarze eukariotyczni

Answer 33

Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris

Question 34

Zapobieganie utracie cech

Answer 34

Przechowywanie w warunkach presji selekcyjnej, ulokowanie elementów na chromosomie, ulokowanie genów niezbędnych na plazmidzie, szczepy samobójcze (letalny marker na chromosomie i represor na plazmidzie)

Question 35

Cel przechowywania drobnoustrojów

Answer 35

Zapewnienie czystości i stabilności genetycznej, zachowanie charakterystyk produkcyjnych, powtarzalności i wydajności procesów

Question 36

Formy przechowywania drobnoustrojów

Answer 36

W obniżonej temperaturze lub w formie bezwodnej

Question 37

Jakie formy drobnoustrojów są przeznaczane do przechowywania?

Answer 37

Spory lub przetrwalniki, a w przypadku nieprzetrwalnikujących – organizmy z wegetatywnej fazy wzrostu

Question 38

Charakterystyka pożywki dla drobnoustrojów przeznaczonych do zamrożenia

Answer 38

Podłoża minimalne (uniemożliwienie zbyt obfitego wzrostu i wyhamowanie procesów metabolicznych), ograniczenie źródła azotu w zwiększonym stężeniu soli promuje sporulacje

Question 39

Krioprotektanty

Answer 39

Glicerol, odtłuszczone mleko, DMSO, glikol propylenowy i etylenowy

Question 40

Czynniki ochronne (zamrażanie drobnoustrojów)

Answer 40

pepton, serwatka, surowica krwi, sacharoza, dekstran, laktoza

Question 41

Witryfikacja

Answer 41

Zamrożenie do bardzo niskiej temperatury (ciekły hel) na tyle szybkie, że nie dochodzi do wytworzenia kryształów lodu

Question 42

Liofilizacja

Answer 42

Suszenie próżniowe. Wymaga specjalnej aparatury i pożywek ochronnych (mleko, osocze)