MP ulepszanie mikroorganizmów Flashcards
Kiedy opłaca się ulepszać drobnoustrój do celów przemysłowych?
Jeśli nakład nie przekracza 3 letnich oszczędności/dochodów
Rodzaje zabiegów stosowanych do ulepszania drobnoustrojów
Zmiana warunków hodowli i zmiany genetyczne
Modyfikacje enzymów anabolicznych i katabolicznych w kierunku nadprodukcji
Enzymy anaboliczne (biosyntezy): brak produkcji lub brak rozpoznania represora, enzym kontrolujący asymilację składnika wydzielany poza komórkę; Enzymy kataboliczne (rozkładu): enzym indukcyjny zmieniony na konstytutywny (niezależny od substratu), enzym aktywny w obecności represora (niewrażliwy na sprzężenie zwrotne), odporność na represję kataboliczną
Na jakim etapie ma miejsce regulacja syntezy enzymów u mikroorganizmów?
Na poziomie inicjacji translacji
Na czym polega kontrola pozytywna i negatywna transkrypcji?
Pozytywna – związanie aktywatora/induktora przed operatorem promotorem; Negatywna – związanie represora w obrębie operatora/za promotorem
Operon laktozowy – kontrola pozytywna czy negatywna? Jak działa?
Kontrola negatywna – w obecności allolaktozy (induktora) represor nie może wiązać induktora
Czy IPTG jest substratem β-galaktozydazy? Czy wiąże się do represora? Do czego służy?
Nie jest substratem β-galaktozydazy. Wiąże się do represora i go inaktywuje. Służy do indukcji operonu laktozowego w hodowli.
Czy X-Gal jest substratem β-galaktozydazy? Czy wiąże się do represora? Do czego służy?
Jest substratem β-galaktozydazy. Nie wiąże represora. Służy do selekcji mutantów konstytutywnych β-galaktozydazy.
Operon maltozowy – kontrola pozytywna czy negatywna? Jak działa?
Aktywator bez maltozy (induktor) nie wiąże się do operatora. Po dodaniu maltozy wiąże się i rekrutuje polimerazę do promotora.
Czym jest efekt glukozowy?
Gdy w pożywce obecna jest glukoza i np. laktoza, to bakterie ignorują laktozę (operon lac nie jest aktywowany mimo obecności induktora).
Czym jest represja kataboliczna?
Mechanizm regulacji polegający na zahamowaniu ekspresji genów niektórych szlaków biochemicznych w obecności preferowanego źródła energii.
Co jest sygnałem „głodu” glukozowego? Co powoduje?
Pojawienie się cAMP. Powoduje zatrzymanie represji katabolicznej i umożliwienie działania np. operonu lac w obecności laktozy.
Diauksja
Wzrost dwufazowy – gdy w pożywce obecne są dwa źródła węgla (np. glukoza i laktoza) to najpierw zużyte zostanie źródło preferowane (glukoza), potem nastąpi faza przystosowania (lag) i po czasie zacznie być zużywane drugie źródło węgla.
W jaki sposób selekcjonuje się mutanty „enzym indukowany → konstytutywny”?
Sekwencyjna hodowla na zmianę na podłożach z induktorem i bez (przerośnięcie komórek niezmutowanych przez konstytutywne mutanty); Hodowla na podłożu ze źródłem węgla będącym słabym induktorem ale dobrym substratem; Hodowla w chemostacie – induktor czynnikiem ograniczającym wzrost z innymi składnikami w nadmiarze, stężenie induktora poniżej potrzebnego do indukcji (przewaga selekcyjna mutantów)
Selekcja bakterii Bacillus z proteazami niezależnymi od obecności aminokwasów
Izolacja szczepów zdolnych do sporulacji w obecności aminokwasów (normalnie hamują proteazy i sporulację)
Selekcja uniezależnienia od represji katabolicznej
Selekcja rewertantów wśród szczepów niezdolnych do produkcji danego enzymu – możliwa rewersja na drodze niezależnej od represji katabolicznej
Czym są izoenzymy?
Izoenzymy katalizują tą samą reakcję, ale mają odmienne właściwości biochemiczne (np. inne optimum pH) i inne sposoby kontroli aktywności
Sterowanie metabolizmem przez regulację szlakami metabolicznymi
Zablokowanie syntezy represora (produktu końcowego), zablokowanie niepożądanych ścieżek szlaku („rozgałęzień”, np. przez nadmiar produktu tego odgałęzienia), eliminacja pierwiastków śladowych z podłoża, zmiana pH, sterowanie stężeniem czynnika limitującego,
Sposoby uzyskania nadprodukcji (podsumowanie)
zwiększenie syntezy enzymu, zamknięcie „rozgałęzień” szlaku, uwolnienie od regulacji (sprzężenia zwrotnego ujemnego), przekierowanie innych ścieżek metabolicznych (np. rozkład glukozy przez szlak pentozofosforanowy zamiast przez glikolizę), zmniejszenie innych szlaków do minimum, eksport produktu na zewnątrz (obniżenie lokalnego stężenia i zmniejszenie działania sprzężenia zwrotnego + łatwiejsze oczyszczanie)
Mutanty selekcyjne i nieselekcyjne
Mutanty selekcyjne wybieramy pod względem danej cechy (np. kolonia wyrosła w obecności antybiotyku – mutant odporny na antybiotyk); Mutanty nieselekcyjne wymagają więcej pracy – mutanty odróżniają się widoczną cechą od typu dzikiego, ale jego właściwości wymagają sprawdzenia na drodze screeningu
Selekcja pozytywna i negatywna
Pozytywna: skierowana na mutanta; Negatywna: skierowana przeciw szczepowi rodzicielskiemu
Selekcja penicylinowa
Penicylina zabija jedynie rosnące komórki. Mutanty auksotroficzne na pożywce bez czynnika wzrostowego nie rosną, wild type rosną ale są zabijane przez penicylinę. Po odpłukaniu penicyliny na medium z czynnikiem wzrostowym rosną mutanty (i niedobitki WT ewentualnie)
Naturalna rekombinacja
Przekazanie materiału genetycznego z komórki dawcy do biorcy w wyniku fizycznego kontaktu komórek na drodze wymiany homologicznych fragmentów DNA dawcy i biorcy. Pozwala na „nieprzyczepienie plakietki GMO”.
Cel naturalnej rekombinacji
Pozyskanie nowego materiału genetycznego i użycie go do wzbogacenia genotypów szczepów produkcyjnych
