Methodes Flashcards
Solubilite adn
Precipite par
Sont comment en solutions acqueuses
:Solubles dans phénol, solutions salines et
alcalines
Précipités par l’alcool et les solutions acides fortes
En solution aqueuse, ils sont très acides
Viscosité adn
ADN long et mince donc solution très visqueuse
Les bases absorbent dans l’UV avec un
maximum à
260 nm
Pureté de l’ADN : utilisation du rapport A260/A280
Rapport entre 1,8 et 2
PCR : Technique
Multiplication ou Amplication in vitro de faibles séquences spécifiques
d’ADN en très grande quantité.
Son principe repose sur l’utilisation de l’ADN polymérase
La PCR est donc une technique de purification ou de clonage. L’ADN extrait
à partir d’un organisme ou d’un échantillon contenant des ADN d’origines
diverses n’est pas directement analysable.
A partir d’une masse de séquences que constitue l’ADN matriciel, la PCR
peut donc sélectionner une ou plusieurs séquences spécifiques et les
amplifier par réplication à des dizaines de milliards de copies.
La PCR permet
la réplication in vitro de multiples copies
d’un fragment d’ADN à partir d’un extrait matriciel.
L’ADN matriciel: 3
l’ADN génomique
l’ADN complémentaire obtenu par RT-PCR
l’ADN mitochondrial
La réaction de polymérisation en chaîne est réalisée dans un mélange
réactionnel qui comprend: 6
l’extrait d’ADN (ADN matriciel)
les amorces,
la Taq polymérase,
les quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP) en excès
la solution tampon.
durée des cycles
Un cycle standard PCR se compose de 3 étapes
+duree d’un cycle
:dénaturation,
hybridation (annealing) et élongation
Durée d’un cycle: 2min
La dénaturation d
constitue la première étape
s’effectue à une température de 94°C – 95°
C
ADN double-brin se dénature en ADN
simple-brin (ADN monocaténaire)
L’Hybridation d
deuxième étape
Température entre 40 – 70°C
Plus la température d’hybridation est
élevée, plus l’hybridation est sélective,
plus elle est spécifique
L’élongation d
température de 72°C, dite température d’
élongation.
A 72°C, la Taq polymérase se lie aux
amorces monocaténaires et catalyse la
réplication
RT-PCR ( Reverse Transcriptase PCR) d
Il s’agit de copier un brin d’ARN en ADN par la transcriptase inverse puis de
réaliser la PCR sur l’ADN obtenu.
PCR : Technique
Dans un premier temps, les ARN totaux sont extraits. Les ARNm sont isolés à
partir des ARN totaux par chromatographie d’affinité grâce à des oligodT
(oligonucléotide polyT), car les ARN messagers se caractérisent par une
séquence polyA en 3’.
Puis , les ARNm sont soumis à la transcriptase inverse qui va générer une
copie d’ADN (ADNc) de chaque ARNm.
Les ARNm sont hydrolysés (traitement alcalin, RNase ou température).
Les étapes suivantes sont réalisées dans l’enceinte du thermocycleur. Les
ADNc monocaténaires sont alors répliqués par l’ADN polymérase au cours
d’un premier cycle de température. D’autres cycles sont réitérés afin
d’amplifier les ADNc bicaténaires en grande quantité.
La PCR quantitative en temps réel
(Quantitative real-time PCR) d
Mise au point au milieu des années quatre-vingt dix, la PCR
quantitative permet de déterminer le taux d’ADN ou d’ARN
spécifiques dans un échantillon biologique.
La méthode est basée sur la détection d’un signal fluorescent qui est
produit de façon proportionnelle à l’amplification du produit PCR,
cycle après cycle.
La fusion haute résolution ou High resolution melting (HRM) d
Technique de criblage rapide d’une population avant de passer au séquençage
pour déterminer la mutation
Le Séquençage nucléotidique d
Initiation de la polymérisation de
l’ADN à l’aide d’une amorce complémentaire.
- Élongation de l’amorce par des ADN
polymérases thermostables (PCR).
- Addition des quatre
désoxyribonucléotides (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP) et d’une faible concentration de
l’un des quatre
didésoxynucléotides (ddATP, ddCTP,
ddGTP ou ddTTP).
Ces ddNTP une fois incorporés dans le
nouveau brin synthétisé, empêchent la
poursuite de l’élongation.
La terminaison se fait de manière statistique
sur toutes les positions possibles.
Technique de Sanger d
ADN polymerase ( synthese de brin complementaire)
Utilisation des (ddNTP) pas de OH en 3’
(les ddNTP marqués au fluorochrome)
leur incorporation stoppe l’élongation de la chaîne
nucléotidique
Séquençage nucléotidique
Aujourd’hui : seuls les
ddNTP marqués au
fluorochrome
Séquençage nucléotidique
Séparation des différents
fragments sur
Séparation des différents
fragments sur gel de
polyacrylamide ou sur
séquenceur.
Les enzymes de restriction
O,classe,sequences de nucleotides reconnues
Sont extraites de micro-organismes le plus souvent des bactéries
Appartiennent à la classe des endonucléases
Séquences de nucléotides reconnues : séquences dites palindromiques
constituées de 4 ou 6 paires de bases
Eco RI enzyme
Extraite de
Escherichia coli RY
site reconnu: G / AATTC
Sma I enzyme
Extraite de
Serratia marcescens
site reconnu: CCC / GGG
Pst I enzyme
Extraite de
Providencia stuarti
site reconnu: CTGCA / G
Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de
coupures:
la coupure à bouts francs
une coupure au milieu de la séquence palindromique.
et la coupure à bouts collants.
coupure qui se fait de part et d’autre du centre de symétrie
La méthylation de la cytosine (sur le carbone 5) ou de l’adénine
(sur l’azote 6) appartenant à des sites de restriction aboutit à
une
inactivation de l’enzyme de restriction correspondante.
Un vecteur de clonage est
Proprietes
est une petite molécule d’ADN qui possède les
propriétés suivantes :
pouvoir se répliquer dans une bactérie fortement amplifiable
posséder des sites de restriction permettant d’introduire le fragment d’ADN à
cloner
Vecteur de clonage
posséder 2 types de marqueurs :
marqueurs de transformation qui permet de faire la distinction entre des
bactéries transformées (ayant reçu le vecteur) et les autres marqueurs de
recombinaison qui permet de faire la différence entre des bactéries ayant reçu
le vecteur seul de celle ayant reçu le vecteur recombinant (c’est à dire avec
l’ADN d’intérêt).
Vecteur de clonage
Existe trois types de vecteur de clonage :
plasmidiques, viraux et cosmides
(phage associés à des plasmides)
Méthodes de sélection des bactéries transformées d
Culture dans milieu contenant un antibiotique
Si la bactérie est sensible à un antibiotique et le plasmide possède un
gène de résistance au même antibiotique ( ex ampicilline)
Seules les bactéries ayant incorporées les plasmides résistent et
poussent dans le milieu.
Méthodes de sélection des bactéries transformées
Reconnaissance des bactéries avec
Reconnaissance des bactéries avec
plasmides intacts des bactéries
avec plasmides recombinants
