intra bio mol (3) Flashcards
définie transgenèse
insertion de gène étranger
deux types de catégories
classique (croisement/ mutagène)
génétique (transgénèse/ manipulation)
étape de transgenèse
1- choisir gène de choix
2- amplifier gène d’intérêt dans un plasmide (PCR)
3- insérer plasmide dans une bactérie
4- infecter la cellule végétale ou animal avec bactérie
5- sélection sur gélose avec antiobios les bacts ayant intégrées le plasmide
les étapes de la PCR
- dénaturation
- hybridation
- élongation
combien d’amorces faut-il
une fwd une rev
température adéquate de dénaturation de la Taq
72 C
que veut dire PCR
polymérisation en chaine
ce qui peut être limitant a la PCR
- dNTPs
- amorces
- tampon
que se passe til lors de la dénaturation
augmentation de la T= bris des liens H entre les brins complémentaires
que se passe til lors de l’hybridation
la température diminue et les amorces se lie à la matrice
que se passe til lors de l’élongation
la température est à la température optimale pour l’enzyme polymérase
comment se nomme le produit de PCR
amplicon
de quoi dépend le nombre d’amplicon
dNTPs dispo (pour polymériser brin)
nbre de cyles
qté réactifs
(2¨n-2n)
définie le polymorphisme
présence de plusieurs allèles pour 1 gène dans une population
applications de la PCR
- identification de polymorphisme
- diagnostic infections
- diagnostic prénataux
- analyse de l’expression de gènes
- mutagenèse
comment on utilise la PCR pour identifier les polymorphismes
on observe les différents allèles présents
qPCR
quantitatif
RT-PCR
qualitatif
que sont les enzymes de restriction
des endonucléases
cmb de nucléotides forment le site de restriction
4-8 (la plupart sont des palindromes= meme séquence dans les deux sens)
plus il y a de nucléotides sur la séquence de restriction
plus il sera rare de la trouver en copie dans l’ADN (plus de chance de fixer la bonne)
types de coupure des enzymes de restriction
- franche (extrémité double brin)
- cohésive (extrémité libre)
L’ADN ligase forme quel type de liaison
les liens phosphodiesters (relie donc 2 fragments d’ADN)
les extrémités cohésives ou franche facilite la liaison?
cohésive
les extrémités cohésives assurent un clonage comment
directionnel= dans un sens
est-il important de réutiliser la meme enzyme si l’on veut la meme extrémité
oui, ainsi le site de restriction est reproduit
quel role joue l’agarose du gel
tamis moléculaire (laisse passer les petites)
les colorants ajoutés pour visualiser la migration permettent-ils de visualiser l’ADN
non, on utilise donc un agent intercalent comme le bromure d’éthidium qui devient fluorescent lorsque exposer aux UV
pk il y a parfois des smear
plusieurs fragments de taille semblable sont présents
L’ADN plasmidique s’observe plus facilement ou difficilement au gel
plus facilement, car fragments plus petits= cartographie de restriction
quelle est la différence entre le site de restriction et le nbre de fragments produits
1- ou l’ADN est clivé
2- selon la PCR, les réactifs
que doivent posséder les plasmides bactériens
- origine de réplication
- marqueur de sélection (gène de résistance)
- site de multiclonage (permet insertion de fragments de restriction)
les résultats possibles de l’enzyme de restriction
plasmide non recombiné
Plasmide recombine (YAY)
ADN non recombinant
que permet le vecteur de propagation
répliquer le vecteur (et l’info qu’il contient) en grande qté
le vecteur de propagation sera til transcrit
NON
le vecteur d’expression sera til transcrits
OUI, il possède un promoteur
caractéristiques communes aux plasmides
origine de réplication (facilite ou ralenti le nbre de copies produites)
sites de multiclonage
marqueur de sélection
fragments à insérer et le plasmide doivent posséder quoi en commun
un coupure cohésive compatible ouuu avoir ete coupé avec la meme enzyme
comment on nomme la capacité naturelle d’intégrer de l’ADN libre
compétence génétique
à quoi sert le lacZ
choisir les gènes ayant intégré les plasmides recombinés= couleur différence de ceux avec les plasmides non-recombinés (X-gal est bleu et transcrit si gène non inséré= non recombiné)
transfo définition
insertion gène étranger dans procaryote
transfection def
insertion gène étranger dans cellule eucaryote
transduction
transfert ADN dans bactérie par l’entremise de phages (virus)
comment on rend une bactérie compétente
- électropo
- soln cations divalents
- choc thermique aussi
quels sont les deux types de transfection
- transitoire: indépendant du génome
- stable: intégré au génome
quelles sont les séquences qui entourent le gène d’intérêt
les border séquences
deux types de transfections chez les plantes
- gamètes (transmissible)
- cals
BESOIN D’UN MARQUEUR DE SÉLECTION
possible aussi chez animaux VIA blastocytes
CRISPR: quel est son endonucléase
Cas 9= endonucléase (qui sert normalement à cliver des virus en suivant un guide d’une infection précédente)
comment on utilise CRISPR
- arn guides
- plasmides
- plasmides dans Agrobacterium (transfo)
- transfection dans cellule végétale
- marqueur de sélection et infection par la bactérie
méthode de Sanger
ddNTPs modifiés qui ne possèdent pas de OH en position 3’ = pas de liaison phosphoester possible= fin
on connait donc tous les nucléotides complémentaires (séparation par électrophorèse)
BUT: SÉQUENCER UNE GRANDE QTÉ DE PETITS FRAGMENTS
à la place de transcrire on fait quoi mtn
chromato sur colonne= ddNTP fluorescents= transmission de chaque fluorochrome
