Hoorcollege 4: Tijdlijn van Genome Sequencing Flashcards
In 1859 ‘the origin of species’ was published by…
Charles Darwin
In 1865 Mendel published his experiments about…
Pea plants and heritance
How long did it take to resolve the structure of the DNA double helix?
Almost a century
When was the human genome completed?
2001
Wie presenteerde voor het eerst het model van de DNA-dubbelhelix?
Watson en Crick
Wat is de definitie van een kloon?
Een collectie van compleet identieke items
Name several reasons/techniques why molecular cloning is important
Sequence analysis,
Genetic engineering (e.g. site-directed mutagenesis)
Express a protein for gene function analysis
Produce proteins / hormones for medical use
Make model systems with a defect in that gene
etc. etc.
Op welke 3 manieren kunnen cloning vectors gebruikt worden?
- plasmiden
- fagen / virussen
- YACs en BACs
Hoe beschermd een bacterie zijn eigen DNA tegen restrictie enzymen?
Door modificatie op de restrictie-sites
Problem: Some human genes are too large to be cloned
into a plasmid (e.g. 200 kb). What is the solution?
- Isolate mRNA (with a poly-A tail)
- Make complementary DNA (cDNA) using reverse transcriptase
- Clone cDNA fragments = a cDNA library
Genomic library =
a collection of plasmids containing pieces genomic DNA
A cDNA library =
a collection of plasmids containing pieces of cDNA
Wat is er anders aan een dideoxy nucleotide vs een normale nucleotide?
De eerste OH-groep (vanaf 3’) is vervangen door een H
Hoe wordt de methode waarbij er een dideoxy nucleotide wordt gebruikt genomed?
Sanger Sequencing
Wat is het voordeel van radioactieve nucleotide tov dideoxy nucleotiden?
Om sentitieve detectie te hebben van de DNA bands
Is cycle sequencing linear of exponentieel geamplificeerd?
Linear
Wat was het voordeel van de ontdekking van fluorescente labeling?
1 buisje ipv 4
What are the four steps of molecular cloning?
- First, a unique DNA fragment is inserted into a cloning vector (such as a plasmid) .
- The plasmid is then transferred into a bacterial cell .
- The single cell is allowed to grow to form a colony, containing millions of cells, each containing an identical copy of the inserted DNA .
- Finally, large quantities of cells can be harvested and the DNA isolated .
What is the aim of molecular cloning?
Producing many identical copies
Welke twee obstakels moesten worden overkomen om PCR toe te passen?
Er is een primer nodig (lastig als je de sequence niet weet) en moet gemixt worden in vloeistof
Wat zijn polonies?
Identieke kopieën van een uniek DNA fragment
Polonies is een combinatie van welke twee woorden?
Polymerase en colonies
Hoe is Next-Generation Sequencing (NGS) anders dan eerste-generatie sequencing?
Er kan een massieve hoeveelheid monsters tegelijkertijd geanalyseerd worden in 1 mix
Wat is Massively Parallel Sequencing?
Hetzelfde als NGS
Wat zijn de 4 stappen van NGS?
1 . Sample preparation (=library construction)
2 . Template amplification
3 . Parallel sequencing
4 . Data analysis
Wat houdt sample preparation in?
Eerst wordt het te onderzoeken DNA-fragment geïsoleerd uit het weefsel of uit de cellen waarvan het afkomstig is. Genomisch DNA wordt vervolgens gefragmenteerd, RNA zou eerst omgezet moeten worden in complementair DNA. Bij de DNA-fragmenten worden adapters (stukjes dubbelstrengs DNA met een bekende sequentie) toegevoegd, die m.b.v. ligase aan de uiteindes van de DNA-fragmenten kunnen binden. Voordat dit kan gebeuren wordt er eerst voor gezorgd dat mogelijke ‘enkelstrengs overhangs’ aan de uiteindes van de DNA-fragmenten worden weggehaald (DNA-polishing). Hierna wordt er aan ieder 5’ uiteinde een enkele nucleotide toegevoegd, deze nucleotide past precies op de adapter die vervolgens kan binden m.b.v. ligase. De adapters komen in dit mengsel in overvloede voor, om te voorkomen dat er te weinig adapters zijn voor al het DNA en zo ervoor te zorgen dat ieder DNA gebonden kan worden aan een adapter.
Wat houdt template amplificatie in?
Bij deze stap is het van belang om het te onderzoeken DNA met gebonden adapters te amplificeren, zodat er heel veel kopieën ontstaan van de DNA-fragmenten. Hierbij wordt er gebruik gemaakt van de PCR-methode, hierbij zijn de primers complementair aan de sequenties van de adapters. Zo wordt elk stukje DNA geamplificeerd, ondanks het feit dat de sequenties van sommige DNA-fragmenten (nog) onbekend zijn.
Wat houdt parallel sequencing in?
Er zijn hiervoor verschillende methodes, een van deze methodes is: sequence-by-synthesis methode. Hier worden alle vier de nucleotiden en DNA-polymerase toegevoegd bij de flow cell. Hierbij worden de vier nucleotiden gelabeled met elk een andere kleur fluorescentie. Wanneer er een nucleotide bindt die complementair is aan de DNA-streng die vastzit aan de flow-cell, wordt de streng bestraald met licht. Vanwege het fluorescentie label ontstaat er een bepaalde emissiegolf die een computer kan opvangen en kan lezen als een van de vier kleuren. Per cyclus kan er 1 nucleotide aan toegevoegd worden, dus wordt de lengte van streng bepaald door het aantal cycli. Als het binden van nucleotiden compleet is, laat de nieuwe streng los.
Wat houdt data analyse in?
De nieuwe gesynthetiseerde strengen/sequenties worden door de computer geanalyseerd om zo overlappingen in sequenties te herkennen. Hoe meer overlappende sequenties, hoe vaker een nucleotide door de computer gelezen is. Meestal krijg je uit deze analyse té veel informatie, specifieke informatie wordt eruit gefilterd a.d.h.v. speciaal ontworpen computerprogramma’s.
Waar staat WES voor?
whole exome sequencing
Wat gebeurd er bij WES?
Eerst wordt het genetische DNA van de patient verrijkt voor alle coderende sequencen, en dan wordt dit volledig gesequenced.
Wat zijn andere vormen van WES?
RNA sequencen en niet-invasieve prenatale testing (NIPT)
Hoe veel kostte het HUGO (human genome project) ongeveer?
2.7 biljoen dollar
