Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

Medical Genomics > Hoorcollege 10: Genome manipulation techniques > Flashcards

Hoorcollege 10: Genome manipulation techniques Flashcards

You may prefer our related Brainscape-certified flashcards:
USMLE® Step 1 flashcards
1
Q

Wat is forward genetics?

A

het aanbrengen van willekeurige mutaties in een populatie en de gemuteerde organismen onderzoeken op het gen dat verantwoordelijk is voor de mutatie (identificeren van genen die verantwoordelijk zijn voor het nieuwe fenotype)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Wat is reverse genetics?

A

een specifiek gen wordt gemuteerd, zodat dit gen verder onderzocht kan worden op zijn functie (identificeren van het bijhorende fenotype van de mutatie).

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Waar kunnen willekeurige mutaties in het DNA door worden veroorzaakt?

A

Chemicaliën, radiatie of transposons

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Chemische mutagenese wordt het meest vaak toegepast. Wat zijn de 3 voordelen hieraan?

A
  1. Zulke mutagenen veroorzaken een substitutie van een enkele nucleotide
  2. op een voorspelbare frequntie
  3. bijna geheel willekeurig in het genoom
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Wat zijn de twee meest gebruikte chemische mutagenen?

A

ENU (N-ehyl-N-nitrosourea) en EMA (ethyl methane sulfonate)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Waar zorgt ENU voor?

A

ENU (N-ethyl-N-nitrosourea) zorgt dat zijn ethylgroep op basen (meestal thymine) wordt geplaatst. Bij een muis kan ENU 1 nieuwe mutatie aanbrengen per 700 gameten.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

Waar zorgt EMS voor?

A

EMS (ethyl methane sulfonate) zorgt dat zijn ethylgroep op guanineresiduen wordt geplaatst. De ethylguanine base wordt door DNA-polymerase herkent als adenineresidu, wat resulteert in substitutie van een enkele nucleotide. EMS kan 1 nieuwe mutatie per 200 gamaten aanbrengen.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Wat voor type mutagenese wordt het meest toegepast in modelorganismes zoals wormen, vliegen en muizen?

A

Transposon-induced mutagenese

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Wat is het principe van een transposon?

A

Transposons kunnen zich uit het DNA halen en zich ergens anders in het genoom weer invoegen. Deze herplaatsing gebeurd willekeurig, soms wordt er dan een coderende regio onderbroken door de ingevoegde transposon.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Welk transposon wordt vaak gebruikt bij vliegen?

A

P-element transposon

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Waarvoor wordt het P-element transposon vaak bij vliegen gebruikt en hoe?

A

Bij vliegen wordt de transposon P-element veel gebruikt, waarbij ‘breeding strategies’ worden toegepast om de activiteit van transposase te controleren. Hierdoor kan transpositie van het P-element aan het begin van de screening geïnduceerd worden, waardoor zijn locatie stabiel blijft. P-elementen kunnen ook gebruikt worden om mutante allelen voor hetzelfde gen met de transposon te maken (imprecise excision). Hierbij zorgt het weghalen van een transposon op de ene plek ervoor dat het omringende DNA daar ook wordt weggehaald. De grootte van de deletie is variërend, waardoor je allerlei allelische varianten krijgt.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Waarom is het gemakkelijker om a.d.v. een transposon een gen te vinden?

A

Voor het identificeren van het gen dat verantwoordelijk is voor de mutatie is het gebruik van transposons makkelijker, omdat de DNA-sequentie van het transposon bekend is en gebruikt kan worden om een primer te maken om zo de transposon te vinden in het ‘gemuteerde’ gen.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Waar bestaat een transgen uit?

A

een promotor regio, een coderend gebied en een poly(A) signaal

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Hoe wordt een transgen ingebracht (in het algemeen)?

A

Het transgen wordt in het genoom geïntroduceerd via insertie van het transgen in de kern van geslachtscellen of embryo’s

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Waar wordt een transgen bij een worm ingebracht

A

In het cytoplasma van gonaden (meerdere cellen worden getarget tegelijkertijd)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Waar wordt een transgen bij een muis ingebracht?

A

In individuele embryo’s

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Hoe wordt een transgen in een muis ingebracht?

A

Deze worden geïsoleerd vanuit de eileiders, maar worden nog omringd door follikelcellen (cumulus cellen). Deze worden door het enzym hyaluronidase weggehaald, waardoor de zona pellucida, poollichaampje en de twee pronuclei zichtbaar worden. De zygote wordt door zuiging van een pipet vastgehouden, waarbij een andere pipet gebruikt wordt om DNA (volume van 1-2 picoliter en concentratie van 4 ng/µl) in de pronucleus te injecteren. Als dit goed gaat, zwelt de pronucleus op en wordt de zygote geïncubeerd totdat die een 2-cell stage embryo heeft gevormd. Hierna worden ze terug in de baarmoeder gedaan van een draagmuis en ontwikkelen ze zich verder.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
18
Q

Hoe kan de aanwezigheid van een transgen bevestigd worden?

A

Genotype analyse

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
19
Q

Hoe wordt een muis genoemd die het transgen bij zich draagt?

A

Founder muizen / founders

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
20
Q

Wanneer is een transgen stabiel?

A

wanneer het exogene DNA willekeurig in het genoom is geïntegreerd

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
21
Q

Kan een transgen beter circulair of lineair worden toegediend?

A

Lineair

22
Q

Waarom is het belangrijk om de expressie levels en de weefsel-specificiteit van de transgenen voor elke transgene founder vast te stellen?

A

De transcriptie van het transgen kan beïnvloed worden door de omgeving en hierdoor is het expressiepatroon niet goed te voorspellen

23
Q

Wat is het principe van homologe gene targeting?

A

Hierbij wordt een specifieke chromosomale regio vervangen met een ontworpen exogeen DNA. Dit gaat via homologe recombinatie (uitwisseling van twee identieke DNA-strengen)

24
Q

Wat voor vector is er nodig voor homologe gene targeting?

A

Targeting vector

25
Q

Wat bevat een targeting vector?

A

Lange DNA segmenten die identiek zijn met het targetgen, zodat homologe recombinatie kan plaatsvinden

26
Q

Wat is een (eventueel) ongewenst effect bij homologe gene targeting?

A

knockout

27
Q

Door welk eiwit worden embryonale stamcellen pluripotent gehouden?

A

Leukemia inhibiting factor (LIF)

28
Q

Wat moet een targeting vector bevatten?

A

een vector moet armen voor homologe recombinatie en een selecteerbare marker bevatten (meestal neomycine dat resistentie bied tegen G418). Het vervangen van een gen vereist dubbele crossover en heeft hierom twee armen nodig, hierbij is de ene arm korter (1-2 kb) dan de andere arm (6-10 kb).

29
Q

Hoe wordt een targeting vector in ES (embryonale stamcellen) geïntroduceerd?

A

M.b.v. electroporatie.

30
Q

Wordt er gebruik gemaakt van positieve of negatieve selectie bij het identificeren van ES getarget door homologe gene targeting?

A

Positief (bijv G418)

31
Q

Wat komt vaker voor bij homologe gene targeting: willekeurige insertie of homologe recombinatie?

A

Willekeurige insertie

32
Q

In welk stadium van een embryo worden de ES geïmplanteerd?

A

Blastocyt

33
Q

Bevat het embryo gegenereerd m.b.v. gene targeting een mix van wildype en genetisch gemodificeerde cellen?

A

Ja

34
Q

Hoe wordt succesvolle overerving van gemodificeerde cellen genoemd?

A

Germaine transmission

35
Q

Is homologe gene targeting geschikt voor knock-out of knock-in?

A

Allebei

36
Q

Hoe wordt RNA interference (RNAi) ook wel genoemd? (2 antwoorden)

A

Knock-down of gene silencing

37
Q

Wat is het principe van RNAi (interferentie)?

A

Hierbij wordt de activiteit van bepaalde genen onderdrukt door het gebruik van korte mRNA sequenties. De techniek kan uitgevoerd worden bij planten, wormen, menselijke cellen en fruitvliegen.

38
Q

Komt RNAi ook van nature voor in organismen?

A

Ja, maar dit is uiteraard hoog geconserveerd (bij zowel zoogdieren als gistcellen)

39
Q

Welk enzym speelt een belangrijke rol bij RNAi?

A

Dicer enzym

40
Q

Wat doet het dicer enzym?

A

dit enzym herkent het dubbelstrengs RNA als een substraat en knipt het in small interfering RNAs (siRNAs) van 20-22 nucleotiden.

41
Q

Wat doen siRNA’s als het is geknipt door het dicer enzym?

A

siRNAs binden aan een complex genaamd RNA-induced silencing complex (RISC). In het RISC wordt het dubbelstrengs RNA van elkaar gescheiden, een van deze strengen (guide strand) bind vervolgens aan een complementaire sequentie van zijn target mRNA. Als ze volledig complementair zijn aan elkaar, wordt het target mRNA in stukjes geknipt waardoor translatie niet kan ontstaan. Als de strengen niet complementair aan elkaar zijn, zullen ze wel binden aan elkaar maar zal het complex uitstulpingen (single-stranded loops) bevatten. Deze structuur komt ribosomen wel binnen, maar blokkeert hier verdere translatie.

42
Q

Hoe worden gebieden in het mRNA die geschikt zijn voor siRNA te binden geïdentificeerd?

A

A.d.h.v. computer algoritmes

43
Q

Hoe worden sequenties geschikt voor siRNA aangepast zodat deze geïntegreerd kan worden?

A

De sequentie (gegenereerd door de computer algoritmes) wordt gekloneerd in een expressievector. In dezelfde vector zit ook de omgekeerde sequentie. Hierdoor vouwt het RNA zich samen als een hairpin en wordt hierom hairpin RNA of shRNA genoemd. Dit molecuul kan vervolgens verwerkt worden door dicer, waardoor een siRNA ontstaat.

44
Q

Double-stranded DNA breaks (DSB) ontstaan in de natuur best frequent, hierom zijn er cellen die belangrijke DNA-reparerende eiwitten produceren die DSBs herkennen en DNA-reparatie onderdelen rekruteren. Wat zijn technieken hiervoor?

A
  • non-homologous end joining (NHEJ)
  • zinc finger nucleases (ZFNs),
  • transcription activator-like effector nucleases (TALENS)
  • meganucleases (restriction enzymes with exceptionally long recognition sequences)
  • CRISPR/Cas.
45
Q

Een CRISPR repeat region dat codeert voor een aantal CRIPSR-RNA transcripten (crRNAs). Waar codeert zo’n crRNA voor?

A

Elk transcript codeert voor één repeat unit, waarbij elke crRNA een variabele sequentie bevat genaamd een protospacer en een constante sequentie die identiek is aan het CRISP repeat. De sequentie van de protospacer is identiek aan de sequentie van een pathogeen en is 20 nucleotiden lang.

46
Q

Wat is een trans-activerend CRISPR RNA (tracrRNA)?

A

Dit is een niet-eiwit coderend RNA transcript dat aan het crRNA bindt om zo een complex te vormen.

47
Q

Wat is Cas9?

A

een endonuclease dat dubbelstrengs DNA kan knippen. Cas9 vormt een complex met het crRNA en tracrRNA.

48
Q

Welke 3 elementen bevat een operon van CRISPR/Cas?

A

crRNAs, tracr(RNA) en Cas9

49
Q

Als een cel geïnfecteerd wordt met een pathogeen dat een identieke sequentie heeft aan de sequentie van een bepaalde protospacer, kan de protospacer hybridizeren met het DNA van de pathogeen. Wat kan er dan a.d.h.v. Cas9 gedaan worden?

A

Cas9 kan dit DNA knippen, waardoor er een DSB ontstaat en het pathogenische DNA onschuldig wordt.

50
Q

De targetsequentie voor de protospacer moet direct aangrenzen met een 3-nucleotide motif. Hoe heet deze?

A

PAM (Protospacer Adjacent Motif)

51
Q

Wat bevat het motief?

A

NGG (N=willekeurige base, GG=2 opvolgende basen moeten guanine zijn)

52
Q

Hoe wordt CRISPR/Cas in onderzoek gebruikt?

A

Hier worden geen natuurlijke protospacer motieven gebruikt, maar wordt er gezorgd dat Cas9 elke sequentie kan targetten dat een PAM bevat. Ook wordt er geen operon gebruikt dat bestaat uit drie elementen, maar wordt er een operon gebruikt bestaande uit twee elementen:

  • GuideRNA (gRNA), bevat de targetsequentie en de andere constante elementen in het crRNA en tracrRNA.
  • Cas9 enzym

Medical Genomics (16 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions