Hoorcollege 13: Proteomics

Question 1

Waar zorgt fosforylatie voor?

Answer 1

Activatie en inactivatie van enzymen

Question 2

Waar zorgt acetylatie voor?

Answer 2

Eiwit stabiliteit, wordt gebruikt in histonen

Question 3

Waar wordt methylnatie voor gebruikt?

Answer 3

Regulatie van gen expressie

Question 4

Waar wordt acylation (niet acetylation) gebruikt?

Answer 4

Membraan tethering en targeting

Question 5

Waar wordt glycosylatie voor gebruikt?

Answer 5

Cell-cell herkenning en signaling

Question 6

Waar wordt ubiquitinatie voor gebruikt

Answer 6

Destructie van een signaal

Question 7

Waar kan proteomics voor gebruikt worden?

Answer 7

voor bijvoorbeeld de vergelijking tussen eiwitexpressie in ziek en gezond weefsel om zo de diagnostiek voor de ziekte te verbeteren of een nieuw medicijn target te kunnen vinden

Question 8

2D gel elektroforese is een van de oudste proteomics technologieën. De eiwitten worden twee maal op verschillende manieren gescheiden. Hoe?

Answer 8

• Eerst worden de eiwitten gescheiden op basis van hun lading op een strook van polyacrylamide met een continue pH gradiënt. Hierop wordt een lading gebracht, waardoor de negatief geladen eiwitten naar de positieve pool worden getrokken. Het pH-gradiënt zorgt uiteindelijk ervoor dat de pH van het eiwit veranderd, waardoor de lading neutraliseert. Zonder lading beweegt het eiwit niet meer door de gel heen.
• Hierna worden de strook eiwitten overgeplaatst op een andere gel met een constante pH. Hierop wordt ook een lading gebracht, hierdoor kunnen de eiwitten gescheiden worden op basis van hun moleculaire gewicht.

Question 9

Hoe heet het als proteomic profielen van twee verschillende samples met elkaar vergeleken worden?

Answer 9

Differential in gel electrophoresis (DIGE)

Question 10

Wat zijn de nadelen van 2D gel elektroforese?

Answer 10

• Het werkt niet goed met hele grote of hele kleine eiwitten. Ook werkt het niet goed met eiwitten die niet veel tot expressie komen.
• Membraangebonden eiwitten kunnen niet gekarakteriseerd worden. Deze eiwitten zijn helaas de meest veelbelovende drug targets.

Question 11

Wat meten massaspectrometers?

Answer 11

Massa-naar-lading ratio van ionen (heeft: een ionenbron, massa analyzer, ionendetector en een dataverzamelaar)

Question 12

Wat gebeurd er bij ionisatie (mbt massaspectrometers)

Answer 12

moleculen knippen om fragmenten te maken met een ionische lading

Question 13

Wat zijn technieken voor ionisatie?

Answer 13

Electrospray ionization (ESI) en matrix-assited laser desorption/ionization (MALDI)

Question 14

Wat gebeurd er bij ESI/ (Elctrospray ionisation)

Answer 14

ESI gaat gepaard met een scheidingstechniek zoals liquid chromatography of capillary elektroforese. Bij elektroforese kunnen minuscule hoeveelheden gescheiden worden, eiwitten worden hier gescheiden via nauwe buisjes met hoge voltage aan de einden. Het eiwit dat aan het eind eruit komt wordt geïoniseerd, de eiwitten lossen hier op en alleen de geladen peptide ionen blijven over.

Question 15

Wat gebeurd er bij matrix-assited laser desorption/ionization (MALDI)?

Answer 15

• MALDI is anders van ESI omdat het weefsel niet gescheiden hoeft te worden in de eiwitten. Weefsel kan in een matrix gelegd worden dat een chemisch stofje bevat dat UV-licht opneemt, wanneer een laser zich richt op de matrix wordt deze heel heet. Hierdoor verdampen en ioniseren de eiwitten.

Question 16

Wat zijn twee massa analysers (voor het meten van de massa-naar-lading ratio)?

Answer 16

time-of-flight (TOF) en ion-trap

Question 17

Hoe werkt ion-trap?

Answer 17

Ion-trap worden vaak gebruikt bij ESI, ze werken als een soort radio’s en kunnen afgesteld worden om alleen bepaalde ionen met een specifieke massa-naar-lading ratio te accepteren (via een magnetisch en elektrisch veld). Als deze ionen hierdoor worden opgevangen kunnen ze gefragmenteerd worden en zo een massaspectrum te vormen.

Question 18

Hoe werkt time-of-flight (TOF)?

Answer 18

TOF wordt gebruikt bij MALDI. Hierbij krijgen alle ionen van een ionenbron dezelfde soort kinetische energie ((1/2)mv2). Andere ionen hebben andere massa’s en zullen zo door de detector komen met een andere snelheid. De aankomsttijd bij de detector wordt hier gemeten om de massa-naar-lading ratio uit te rekenen.

Question 19

Welk enzym helpt bij het knippen zodat de eiwitten niet te groot zijn voordat ze door de massaspectrometer gaan?

Answer 19

protease zoals trypsine, dit enzym knipt aminzuren na Arg of Lys

Question 20

Hoe wordt er gecontroleerd dat er goed is geknipt?

Answer 20

(theoretical peptide mass finterprint), eerst worden de trypsine knipplekken van alle eiwitten bepaald en van de geknipte stukjes eiwit wordt de (verwachte) massa berekent. Deze berekeningen worden vergeleken met de fragmenten die uit de massaspectrometer komen.

Question 21

Wat is stable-isotope protein labeling?

Answer 21

Dit is een techniek die gebruikt wordt om verschillen in eiwitexpressie bij verschillende experimentele condities te kwantificeren. Stabiele isotopen zijn niet-radioactieve isotopen, ook verschillende isotopen van een element hebben verschillende massa’s en kunnen bij massaspectrometrie een misleidend effect hebben op de massa-naar-lading ratio. Om toch ervan gebruik te maken, kan je de expressie van individuele eiwitten onder verschillende experimentele condities meten. Dit doe je door een eiwit te labelen met een bepaald isotoop via een enzymatische reactie, door isotopen op te nemen in metabolieten (aminozuur dat het isotoop bevat) of via een chemische reactie

Question 22

Noem een voorbeeld van stable-isotope protein labeling

Answer 22

het groeien van bacteriën op verschillende mediums, de ene populatie op een normaal medium, de ander in een medium met aminozuren die de isotoop 13C hebben opgenomen. Deze eiwitten van beide mediums worden gemengd en geknipt door trypsine voor voorbereiding van de analyse. Het massaspectrum van de gelabelde en niet-gelabelde eiwitten vertoont de relatieve aanwezigheid van het eiwit onder twee verschillende experimentele omstandigheden.

Question 23

Kennis over de concentratie van eiwitten in bepaalde pathways of transcriptionele regulatie kan nuttig zijn, maar gaat lastig met de bovenste technieken. ICAT zorgt ervoor dat massaspectrometrie gebruikt kan worden om kwantiteiten te kunnen meten. Hoe gebeurd dit?

Answer 23

Hierbij worden twee eiwit samples gelabeled met elk een andere ICAT reagent. Het labelen komt tot stand door de vorming van een covalente binding tussen cysteine residuen in de eiwitten en de reactieve thiolgroep in de ICAT reagent. De eiwitten worden gefragmenteerd in peptiden, waarbij de peptiden die ICAT bevatten gezuiverd worden via affiniteitschromatografie (herkenning van biotingroep binnen de ICAT tag). Hierna worden de peptiden geanalyseerd door massaspectrometrie en worden ze gekwantificeerd.

Question 24

Massaspectrometrie kan ook gebruikt worden om nieuwe interacties tussen eiwitten te vinden, dit gaat vaak via een pull-down experiment. Wat gebeurd er dan?

Answer 24

Het is gebaseerd op het zuiveren van een prooi-eiwit, waarbij de eiwitten die hieraan binden meegezuiverd worden in deze pull-down procedure. Hierna wordt massaspectrometrie uitgevoerd om de identiteit van de eiwitten te vinden.

Question 25

Wat zijn de nadelen van massaspectrometrie?

Answer 25

• Kleine hoeveelheden eiwitten zijn niet bruikbaar om geanalyseerd te worden.
• Sommige eiwitten zullen post-translationeel gemodificeerd worden en kunnen andere fragmentatiepatronen hebben, waardoor interpretatie van de analyse moeilijk gaat (zoals bij gefosforyleerde eiwitten).

Question 26

Wat wordt er ‘gemeten’ bij protein chips?

Answer 26

de aanwezigheid van eiwitten te meten a.d.h.v. antilichamen, om interacties tussen eiwit-eiwit, eiwit-kernzuur, eiwit-klein molecuul en eiwit-lipide te meten en om enzym-substraat reacties te meten

Question 27

Welke twee soorten arrays zijn er ?

Answer 27

analytical microarrays en functional protein chips

Question 28

Wat doen analytical microarrays?

Answer 28

gebruiken antilichamen of antigenen om bepaalde eiwitten te vinden in de mix op de chip.

Question 29

Wat doen functional protein chips?

Answer 29

gebruiken juist heel veel verschillende eiwitten om hun functie te achterhalen.

Question 30

Vaak wordt fluorescentie om de resultaten van protein chip experiment te lezen, maar soms wordt SELDI (surface enhanced laser desorption/ionization) gebruikt. Hoe werkt dit?

Answer 30

Het lijkt op MALDI, hierbij wordt een laser gebruikt om eiwitten te ioniseren die zich op de chip bevinden, dat vervolgens in de massaspectrometer gaat.

Question 31

Wat zijn de nadelen van protein chips?

Answer 31

• antilichamen maken voor elk eiwit. Dit proces is moeizaam.
• Een protein chip dat bestaat uit meerdere eiwitten. Hiervan moet elk eiwit eerst gemaakt en gezuiverd worden.
• Ontwerpen van een chip die hydrofobe en hydrofiele eiwitten tegelijkertijd detecteert, gaat ook lastig.

Question 32

Wat gebeurd er bij de Yeast-two-hybrid methode?

Answer 32

Hierbij wordt er gebruik gemaakt van de gentranscriptie van gist om de interactie tussen eiwitten te onderzoeken. Gentranscriptie bij gistcellen heeft een DNA-bindend domein en een activerend domein. Het eiwit van interesse (het lokaas) is verbonden met het DNA-bindend domein, het andere eiwit wordt de prooi genoemd en is verbonden met het activerende domein. Als het lokaas en de prooi interactie aangaan met elkaar, dan zal DNA binding en activatie ontstaan en zal er een reportergen tot expressie komen.
Deze methode kan gebruik worden om het interactome op genoomschaal te onderzoeken. Maar het is wel minder sensitief dan andere methoden en ook is er sprake van veel vals positief en negatieven.

Question 33

Waarom heeft biochemical genomics meer sensitiviteit dan expressie-cloning?

Answer 33

problemen door de assays te versimpelen en de sensitiviteit van expression-cloning te verhogen. Dit wordt o.a. mogelijk doordat alle ORFs bekend zijn van ons genoom. Hierbij worden plasmiden gemaakt voor alle ORFs in het genoom, die vervolgens in cellen worden geplaatst. Het ORF is meestal gefuseerd met een tag waardoor het ORF genproduct gezuiverd kan worden. Hierna worden de genproducten samen ‘gepooled’ en getest voor biochemische activiteiten.