Hoorcollege 12: Transcriptomics Flashcards
Wat betekent transcriptie?
Collectie van alle transcripten in een cel
Wat betekent transcriptomics?
Het onderzoek naar het transcriptome
Is de hoeveelheid mRNA in een cel constant?
Nee
Wat wordt gebruikt/zijn de stappen bij Northern Blotting?
RNA, gel-elektroforese, capillary action, DNA-probe gehybridiseerd (met het RNA) dat is gelabeld met een radioactief isotoop/epitoop
Wat zijn de voorwaarden van een Northern blot?
- Het is essentieel om de integriteit van het RNA te verifiëren. Als RNA gedeeltelijk afgebroken is, zal de intensiteit van hybridisatie niet de hoeveelheid RNA accuraat kunnen weerspiegelen.
- Er moeten meer gelabelde probes zijn dan er RNA is. Als dit niet het geval is, zal de intensiteit van hybridisatie enkel de hoeveelheid probes weerspiegelen en zal er geen competitie zijn tussen RNA-moleculen die met de probe willen binden.
- Er moet genoeg tijd zijn voor de probes om hun complementaire RNA te vinden.
- Er moet een onafhankelijke manier zijn hoe aangetoond kan worden dat gelijke hoeveelheden RNA in elke baan van de gel zijn geplaatst. Dit wordt meestal gedaan door een tweede probe te gebruiken die kan hybridiseren met RNA dat in gelijke hoeveelheden voorkomt.
Hoe veel banen en probes kan een northern blot ‘produceren’?
20-40 banen en 3 probes per blot
Wat gebeurd er bij Microarrays?
Microarrays zorgen voor gelijktijdige analyse van de RNA expressie van duizenden genen. Als een genoom volledig gesequenced is, kunnen microarrays gebruikt worden om de expressie van elk gen te analyseren. Een ander verschil is dat microarrays DNA hebben die gebonden zijn aan een solide ondergrond (glas/plastic/nylon membrane) en dat het RNA direct gelabeld wordt of door een cDNA intermediair. Hier is dus het DNA in overvloed, dat bij microarray de probe wordt genoemd en het gelabelde DNA of cDNA wordt de target genoemd. Meestal wordt bij microarray RNA populaties met elkaar vergeleken, zoals tumorweefsel en gezond weefsel.
Wat zijn de twee meest gebruikte microarray technologieën?
mechanical spotting en photolithography
Wat gebeurd er bij mechanical spotting?
. Bij mechanical spotting worden kleine hoeveelheden DNA (nano-picoliter) op glasplaatjes geplaatst. 1 nano- of picoliter DNA is te klein voor een normaal pipet, hiervoor worden robots gebruikt die de precieze hoeveelheid op de precieze plek plaatsen. Dit gaat meestal m.b.v. pinnen die als capillary action werken. Hier worden meerdere pinnen aan elkaar gebonden en tegelijkertijd in het DNA gedipt, het DNA bevindt zich in wells op een microtiterplaat. Hierna verplaatsen de robots de pinnen naar de glasplaatjes en brengt ze in contact met het glas. Door hydrostatische interactie plakt de DNA aan het glasplaatje (dit wordt herhaald). Om de hybridisatiereactie te controleren wordt hetzelfde DNA tweemaal gepipetteerd op de glasplaat.
Een andere manier om DNA op de glasplaatjes te plaatsen is via ink-jet printer technology. Hoe werkt deze techniek?
Ink-jet printers kunnen hele kleine hoeveelheden inkt op een precieze locatie plaatsen. Hier wordt dan geen inkt maar DNA gebruikt. De printer neemt wat DNA op, verplaatst zich naar een bepaalde locatie en werpt het DNA eruit. De technologie kan ook gebruikt worden voor synthese van oligonucleotiden.
Wat heeft meer banen: photolithography of ink-jet printer?
Photolithography
Wat is het verschil tussen spotted microarrays en GeneChips?
Spotted microarrays en GeneChips werken anders in hoe hybridisatie tot stand komt. Bij spotted microarray worden de twee gelabelde targets die met elkaar vergeleken worden gehybridiseerd op dezelfde microarray (competitive hybridization). Bij GeneChips wordt er steeds maar één gelabelde target gehybridiseerd met een chip. De intensiteit van hybridisatie wordt dan bepaald door het vergelijken van twee targets op twee andere chips. Bij competitieve hybridisatie wordt het relatieve verschil tussen de signaalintensiteit van de twee targets gemeten die willen binden op dezelfde plek DNA. Dit is omdat er variabiliteit is in de hoeveelheid en integriteit van het spotted DNA en de relatieve vergelijking dit compenseert.
Het RNA moet ook fluorescent gelabeled worden. Direct labeling maakt gebruik van welk enzym?
reverse transcriptase om een cDNA kopie van het RNA te maken (waar gelabelde nucleotide aan cDNA wordt toegevoegd)
Naast direct labeling , bestaat er ook indirect labeling. Hoe werkt dit?
RNA wordt eerst omgevormd tot dubbelstrengs cDNA dat een herkenningsplek voor RNA-polymerase bevat (via een linker). Een viraal RNA-polymerase wordt vervolgens gebruik om cRNA te maken, in dit mengels zitten dan gelabelde RNA-basen die in het cRNA terecht komen.
Welk type labeling maakt de spotted microarray gebruik van?
Spotted microarray -> competitieve hybridisatie maakt gebruik van Cy3 (=groen) en Cy5 (=rood)(direct labeling).
