Histoteknik Flashcards
Vilket typ av mikroskop används oftast inom histologi och hur fungerar det?
Ljusmikroskop som använder synligt ljus, vanligen en hallogen- eller LED-lampa
De histologiska preparaten är tunna vävnadssnitt, så tunna att de kan genomlysas
Framställningen av dessa innebär flera steg
T.ex. framställningen av paraffinsnitt, fryssnitt och preparat från hårdvävnad (ben och tänder)
Hur går framställningen av paraffinsnitt till?
För att kunna studera vävnader i ett vanligt ljusmikroskop måste man göra mycket tunna snitt/skivor av vävnaden. Provet bäddas därför in i paraffin för att bli tillräckligt hårt
Fixering av vävnaden
Dehydrering
Inbäddning i paraffin
Snittning med mikrotom
Färgning
Montering med täckglas
Hur går framställningen av fryssnitt till?
Används när man snabbt måste få en bedömning eller vid histokemiska undersökningar t.ex. under operation av en tumör för att se om allt är borta
Tar ca 20 min men ej lika hållbart
Frysning av preparatet i flytande kväve eller kolsyreis → tillräckligt hårt för att snittas
Snittning i cryostat = en mikrotom nedsänkt i en frysbox
Färgning
Montering
Hur går framställningen av preparat från hårdvävnad till?
För ben och tänder används två metoder
Urkalkning av preparatet före inbäddning av paraffin. Den fixerade vävnaden läggs ner i en svag syra eller EDTA. Alllt oorganiskt material försvinner och preparatet kan sedan bäddas in i paraffin, snittas, färgas, osv.
Slipsnitt. En tunn skiva av benet sågas ut och slipas ner till en tjocklek som medger genomlysning i mikroskopet, ca 20 mikrometer. Endast oorganiskt material, dvs. kalciumsalter bevaras
Vad är avsikten med fixering och hur går det till?
Avbryta livsprocesserna så att vävnaden blir så opåverkad som möjligt
Vanligt att använda formalin, en lösning av formaldehyd, som bildar korsbryggor mellan proteinmolekylerna
Detta medför denatuering av proteiner så att bakterier och enzymer inte kan bryta ner vävnaden
Vävnadsprovet/biopsin läggs i formalin i några timmar eller dygn beroende på dess storlek
För tunna vävnadssnitt och blodutstryk kan organiska lösningsmedel användas, såsom etanol, metanol eller aceton, där fixering uppstår genom att vattnet i vävnaden ersätts av lösningsmedlet
Vad är avsikten med dehydrering och hur går det till?
Avlägsna allt vatten ur vävnaden så att paraffinet kan infiltrera vävnaden
Görs genom att biopsin läggs i ökande koncentrationer av etanol som tränger bort vattnet och slutligen xylen eller annat lösningsmedel för att få bort resterna av vattnet
Hur går inbäddning i paraffin till?
Den dehydrerade biopsin läggs i smält paraffin i en värmeugn, ca 60 grader, så paraffinet kan tränga in i hela vävnaden
Biopsin läggs i en form med paraffin och tas ut ur ugnen så att paraffinet stelnar - läggs på ett lock så man kan fästa sitt preparat
Den inbäddade biopsin kallas nu en kloss
Hur går snittningen till?
Praffinklossen snittas i tunna skivor, 4-6 mikrometer, m.h.a. en skärmaskin, mikrotom
Det tunna snittet sträcks på ett vattenbad och fångas upp på ett objektglas
Hur går färgningen till och vilka olika metoder finns det?
De flesta celler och vävnader saknar färg och måste därmed färgas för att kunna se detaljerna vilket det finns många olika metoder för
Rutinfärgningar - ger en översiktlig histologisk bild
Histokemiska färgningar - vävnadskomponenter såsom fett, kolhydrater, DNA, RNA, mm. färgas t.ex. glykogen i levern blir rosa och dess cellkärnor blå
Immunhistokemiska färgningar
Specifika molekyler/antigen detekteras m.h.a. en antikropp där antigenen ses som en färg eller fluorscens (ses i ett fluorscens mikroskop)
Vad får färgernas och vävnaders kemiska egenskaper för färgresultat?
Katjonfärger = baser
färgar sura strukturer i vävnaden t.ex. nukleinsyror, DNA, RNA
Basofila kallas de strukturer som färgas med basiska färgämnen
Oftast blåa t.ex. hematoxylin, metylenblått och trypanblått
Oftast för färgning av cellkärnor
Anjonfärger = sura
Färgar basiska strukturer i vävnanden
Acidofila kallas de strukturer som färgas med sura färgämnen
Oftast röda eller rosa
Vanligtvis anjonfärgen eosin
Eosinofil används ofta som synonymt med acidofil
Eosin kombineras ofta med hematoxylin för att ge en översiktlig färgning av preparatet
Vad är den vanligaste standardfärgningen?
Hematoxylin och eosin - Htx/E
Glaset doppas först i hematoxylin och därefter i eosin
Cellkärnor blå, ibland färgas även basofila strukturer i övrigt blå t.ex. RNA
Cytoplasma , muskelvävnad, bindvävsfibrer → rosa/röda
Vilken färgning görs för bindvävspreparat?
van Gieson = bindvävsfärgning t.ex. esophagus och muskelartär
Avsikten är att man ska tydligt kunna skilja mellan binväv och muskelvävnad i vävnadssnitt → ökad mängd bindväv vid t.ex. sjuklig process
En kombination av flera färgämnen används → muskelvävnad (gul), bindväv (röd), cellkärnor (oftast svarta)
Azan är en annan bindvävsfärgning → muskelvävnad (röd), bindväv (blå, oftast starkt blå), cellkärnor (röda), röda blodkroppar (röda)
Hur färgar man tunna tråda t.ex. retikulära fibrer i bindväv?
Metallimpregnering med silversalter
Impregmenterar preparatet med metallsalter, silver- eller guldsalter
Lymfatisk vävnad, lymfnoder och mjälte är uppbyggd av retikulär bindväv och kan tydligt se deras tunna retikulära fibrer som färgas svarta
Lymfocyternas cellkärnor färgas också svart (prickar på bilden)
Vilken översiktsfärgning används framförallt för tunna plastinbäddade preparat istället för paraffininbäddade?
Richardson är en blandning av två olika blå färgämnen, metylblått och Azer II
Alla strukturer färgas i olika nyanser av blått
T.ex. epiglottis och spottkörtel
Mer krånglig och görs därför inte lika ofta
Hur går monteringen till?
Ett litet täckglas fästs över preparatet så att det kan bevaras länge
Paraffinklossen kan också sparas många år om man vill göra nya snitt för nya frågeställningar
Preparaten kan antingen analyseras med ett ljusmikroskop eller scannas in
Vilken mikroskopi är en utveckling av fluorescensmikroskopi och hur går den till?
