Geeniteknologia

Question 1

Yleisimmät geenitekniikan entsyymit (7kpl)

Answer 1

1. RNA- ja DNA polymeraasit
   - nukleiinihappojuosteiden rakennus
   - eristetty kuumien lähteiden bakteereista
2. käänteiskopioijaentsyymi
   - rakentaa L-RNAn pohjalta cDNA:n, joka voidaan liittää bakteerin perimään
   - eristetty retroviruksista
3. RNA-nukleaasit
   - RNA juosteen pilkkominen käänteiskopioinnissa (kun cDNA rakennettu L-RNAsta -> nukleaasit pilkkovat RNA:n, jotta DNA-polymeraasi voi rakentaa cDNAn rinnalle vastinjuosteen
4. katkaisu- eli restriktioentsyymit
   - DNA:n katkaisu määrätyn emäsjärjestyksen kohdalta
   - osa restriktioentsyymeistä jättää sticky endin, jonka avulla katkaistu DNA voi automaattisesti pariutua samalla restriktioentsyymillä katkaistun toisen juosteen kanssa (olemassa myös restriktioentsyymejä jotka katkaisevat ilman tarrapäätä)
5. ligaasit eli liittäjäentsyymit
   - liittävät valmiiden RNA tai DNA juosteiden päät yhteen syntetisoimalla fosfodiesterisidoksen sokerin ja fosfaatin välille
6. cas-entsyymit
   - DNA:n kohdennettuun katkaisuun käytettyjä entsyymejä (käytössä crispr-tekniikassa = DNA:n kohdennettu muokkaus)
   - opas-RNA-molekyylin emäsjärjestys ohjaa pilkkomiskohdan
7. proteaasit
   - proteiineja pilkkovia entsyymejä
   - käytetään esim. proteiinien pilkkomiseen eristettäesssä ja puhdistettaessa DNA:ta tumallisista soluista

Question 2

DNA:n eristäminen tumallisilta

Answer 2

1. DNA näytteen otto, esim. sylki, veri, hiukset
2. näyte jäädytetään nestemäisessä typessä ja solut murskataan mekaanisesti, jotta DNA saadaan irralleen kalvorakenteiden sisältä
3. solukalvojen lipidit irrotetaan pesuaineella ja proteiinit hajotetaan proteaaseilla, jotta DNA irtoaa histoneista
4. proteiinit ja lipidit liuotetaan esim. fenoliin
5. näyte sentrifugoidaan suurella nopeudella, jotta liuotin ja siihen liuenneet proteiinit ja lipidit jäävät sentrifugiputken pohjalle (DNA kevyempänä jää pinnalle vesifaasiin)
6. DNA saostetaan kylmällä etanolilla tai isopropanolilla, jolloin se tulee näkyviin ja voidaan kerätä

Question 3

mitä kahta tapaa käytetään DNA:n monistamiseen?

Answer 3

monistettava DNA voidaan siirtää bakteereihin, jotka jakautuessaan monistavat kyseistä DNA:ta, tai voidaan hyödyntää PCR-reaktiota

Question 4

miten monistettava DNA-jakso siirretään bakteeriin?

Answer 4

plasmidin avulla; DNA-juoste ja plasmidi katkaistaan samoilla restriktioentsyymeillä, jolloin niiden tarrapäät pariutuvat ja geeni saadaan osaksi plasmidia -> sitten plasmidit laitetaan bakteerien kasvualustalle -> koska bakteerit ottavat luonnostaan plasmideja sisäänsä (transformaatio), yhdistelmäplasmidit siirtyvät osaan bakteereista

mistä tiedetään missä bakteereissa halutut plasmidit ovat?
-plasmideihin on myös aluksi liitetty antibioottiresistenttigeeni -> bakteerit laitetaan kasvamaan tätä antibioottia sisältävälle alustalle -> tällä alustalla kasvavat bakteerit sisältävät halutun plasmidin ja geenin = antibioottivalinta

Question 5

PCR eli polymeraasiketjureaktio

Answer 5

• DNA-jakson monistaminen eksponentiaalisesti ilman bakteeriviljelmiä
• tarvitaan DNA-polymeraasia, kaikkia neljää nukleotidia (A T C G) uusien juosteiden rakentamista varten sekä alukkeita (primers)
• käytetyt nukleotidit, samoin kuin solujen vapaat nukleotidit ovat trifosfaattimuodossa (eli niiden sokeriosaan on kiinnittyneenä kolme fosfaattiosaa) -> oleellista koska fosfaattien välisiin runsasenergisiin sidoksiin on sidottuna nukleiinihappojen synteesiin tarvittava energia
• koska DNA-polymeraasi voi sitoutua vain kaksijuosteiseen DNA:han, se aloittaa replikaation alukkeiden sitoutumiskohdista

PCR:ssä toistuu kolme vaihetta:

1. lämpötilan nosto +95C asteeseen -> juosteet erkanevat
2. lämpötilan lasku +55C asteeseen -> alukkeet sitoutuvat DNA-juosteiden päihin
3. lämpötilan nosto +72C asteeseen, jolloin DNA-polymeraasi alkaa kopioida juosteita

näitä vaiheita toistamalla, jokaisella kierroksella DNA:n määrä kaksinkertaisuu eli DNA:n määrä kasvaa eksponentiaalisesti

Question 6

alukkeet

Answer 6

lyhyitä yksijuosteisia, synteettisesti valmistettuja DNA-pätkiä, jotka tunnistavat itselleen vastakkaisen DNA:n emäsjärjestyksen monistettavan alueen päissä, sitoutuvat kyseiseen alueeseen ja rajaavat näin monistettavan alueen

Question 7

(geeli)elektroforeesi

Answer 7

menetelmä, jolla eri kokoisia negatiivisesti varautuneita molekyylejä voidaan erotella toisistaan
-perustuu sähkövirtaan, joka saa tutkittavat molekyylit liikkeelle, sekä rakenteeltaan verkkomaiseen geeliin, jossa molekyylit liikkuvat

Question 8

geelielektroforeesin toiminta ja vaiheet

Answer 8

laitteessa nesteen täyttämä kammio, johon geeli (esim. agaroosi) asetetaan; geelin toisessa päässä näytekuoppia, joihin laitetaan tutkittavia molekyylejä; kammion yhdessä päässä negatiivinen elektrodi ja toisessa positiivinen -> väliin muodostuu sähkökenttä, joka saa näytekuoppiin asetetut molekyylit liikkeelle; esim. DNA ja monet proteiinit negatiivisesti varautuneita, joten ne kulkevat geelissä kohti positiivista napaa; geelin rakenteen vuoksi pienimmät pätkät (lyhyin/kevyin) kulkevat nopeammin; eri etäisyyksille ehtineet molekyylit muodostavat geeliin viivoja, joista kyseiset, tietyn pituiset molekyylit voidaan kerätä ja eristää jatkokäsittelyä varten

Question 9

sekvensointi

Answer 9

menetelmä, jolla selvitetään DNA:n emäsjärjestys; voidaan selvittää koko eliön genomin emäsjärjestys

Question 10

rinnakkaissekvensointi

Answer 10

sekvensoitava DNA pilkotaan eri kokoisiksi paloiksi; laite lukee eli sekvensoi näiden palojen emäsjärjestyksen yhtäaikaisesti ja eri palojen osittain päällekkäisten sekvenssien avulla saadaan koko DNA:n emäsjärjestys selville

Question 11

perinteinen sekvensointimenetelmä

Answer 11

PCR ja elektroforeesi yhdistetään; sekvensointilaitteeseen syötetään PCR:ssä tarvittavien ainesten (näyte, nukleotideja ja DNA-polymeraasi) lisäksi lopettavia nukleotidea, joita kutsutaan dideoksinukleotideiksi.

Question 12

dideoksinukleotidit

Answer 12

lopettava nukleotidi = dideoksinukleotideistä puuttuu 3’-hiilen OH-ryhmä, ja koska polymeraasi voi liittää uuden nukleotidin ainoastaan olemassa olevan juosteen viimeisen nukleotidin OH-ryhmään, DNA:n kahdentaminen PCR:ssä päättyy, kun juosteeseen osuu dideoksinukleotidi -> tutkittavasta näytteestä syntyy monistuksen aikana lukuisia eri mittaisia kopioita, joista jokainen päättyy dideoksinukleotidiin

lopettavat nukleotidit värjätään ennen monistusta fluoresoivalla merkkiaineella siten, että jokaista emästä (ATGC) vastaa tietty väriaine ->tämä voidaan lukea sopivilla laitteilla, ja näin jokaisen syntyneen DNA-pätkän viimeinen nukleotidi on tunnistettavissa väriaineen perusteella.

Question 13

geeninsiirto

Answer 13

tekniikka, jolla eliölle voidaan siirtää esim. toisen eliön geeni -> ilmentyessään siirtogeeni antaa uudelle isännälleen jonkin ominaisuuden, jota tällä ei ennen ollut

Question 14

geeniterapia

Answer 14

geeninsiirron avulla potilaan elimistöön voidaan viedä toimiva versio virheellisesti toimivasta tai toimimattomasta geenistä

Question 15

geeninsiirto bakteerisoluihin

Answer 15

yhdistelmä-DNA-tekniikalla: siirrettävä DNA eristetään näytteestä -> DNA pilkotaan katkaisuentsyymeillä lyhemmiksi paloiksi -> vektorein käytetään usein plasmideja, joita bakteerit muutenkin ottavat sisäänsä (transformaatio)

huom! bakteereilla ei introneita, joten jos siirrettävä geeni tulee tumallisesta solusta, täytyy intronit poistaa ennen geenin siirtoa (l-RNA eristys solusta -> reverskriptaasientsyymillä cDNA…)

lisäinfo! transformaatiota varten solujen tulee olla kompetentteja, bakteerit kuitenkin usein luontaisesti kompetentteja eli ottavat DNAta sisään; kompetenssi voidaan saada aikaan laboratorio-olosuhteilla käsittelemällä solut keinotekoisesti niin että ne läpäisevät DNA:ta

TAI

bakteriofagilla: bakteriofagit bakteereja infektoivia viruksia -> niiden perimä voidaan korvata siirtogeenin kopioilla, jolloin se siirtää bakteeriin oman perimänsä sijasta siirtogeenin, eikä kykene infektoimaan isäntäsolujaan

Question 16

geeninsiirto hiivasoluihin

Answer 16

plasmidien ja keinotekoisten kromosomien avulla (k.t. kromosomit sisältävät siirtogeenin lisäksi merkkigeenin ja telomeerit; ne liittyvät osaksi hiivan genomia ja käyttäytyvät hiivan omien kromosomien tavoin kahdentuen mitoosissa; näihin mahtuu paljon enemmän DNA:ta kuin plasmideihin)

Question 17

mikroinjektio

Answer 17

DNA:ta voidaan siirtää tumaan hyvin ohuen lasiputken avulla; siirtogeenisiin eläimiin geenin siirto ennen hedelmöitystä tai juuri hedelmöittyneeseen munasoluun

Question 18

geeninsiirto eläinsoluun

Answer 18

mikroinjektiolla munasoluun tai esim. siirto soluviljelmään

Question 19

geeninsiirto soluviljelmään

Answer 19

tapahtuu kasvatusliuokseen annettavan lyhyen sähköimpulssin avulla, joka tekee soluviljelmän solujen solukalvoista ja tumakoteloista läpäisevän; liposomi on siirtogeenin sisältävä fosfolipidirakkula, joka siirtyy kasvatusliuoksesta soluihin sulautumalla niiden solukalvoon, vapauttaen sisältämänsä DNA:n solun sisään; myös viruksia voidaan käyttää vektoreina

Question 20

geeninsiirto kasvisoluihin

Answer 20

kasvisoluihin käytetään samanlaisia menetelmiä kuin eläinsoluihin, kuitenkin soluseinä poistettava ennen geeninsiirtoa (protoplasti)

Question 21

protoplasti

Answer 21

kasvisolu, jonka soluseinä poistettu; näihin voidaan siirtää geenejä mikroinjektion, sähköimpulssin tai liposomien avulla tai geenipyssyllä tai kasveja infektoivien agrobakteerien avulla

Question 22

geenipyssy

Answer 22

kasvisoluun (protoplastiin) voidaan siirtää geenejä tällä: soluun ammutaan pieniä DNA:lla päällystettyjä metallihiukkasia esim kultahiukkasia

Question 23

agrobakteerin avulla geenin siirto

Answer 23

siirtogeeni liitetään agrobakteeriin plasmidina (T-DNA), ja bakteerin annetaan infektoida kasvisolu (aiheuttaa kasviin näkyvän kasvannaisen äkämän), siirtäen plasmidit kasvisolun DNAn osaksi

Question 24

geenin poisto

Answer 24

poistettavaksi haluttu geeni voidaan tehdä toimintakyvyttömäksi; poistossa DNA:han liitetään vektorin avulla poistettavaa geeniä vastaava DNA-pätkä, joka korvaa toimivan geenin solun perimästä, mutta ei itse ilmennä mitään.

crispr/cas tekniikka kehittynein geeninpoistotekniikka

Question 25

poistogeenisen eläimen teko

Answer 25

jotta voitaisiin tuottaa poistogeeninen eläin, jonka kaikissa soluissa ilmenee haluttu muutos, geeninsiirto täytyy tehdä alkion kantasoluihin, jotka siirretään blastokystavaiheessa olrviin alkioihin

Question 26

mihin siirtogeenisiä eläimiä hyödynnetään?q

Answer 26

• geenin toimimmam ja säätelyn tutkimiseen elävässä yksilössä
• tautimallien ja hoitojen kehittämiseen
• hyötyproteiien tuotantoon
• eläinjalostuksen tehostamiseen

Question 27

crispr/cas

Answer 27

tekniikassa käytetään hyödyksi syntetisoitua opas-RNA:ta, joka tunnistaa tarkoin määrätyn osan halutusta geenistä emäspariperiaatteen mukaisesti; opas-RNA toimii yhdessä DNA:ta katkaisevan cas-entsyymin kanssa; opas-RNA tunnistaa geenin emäsjärjestyksensä mukaisesti ja sitoutuu siihen; cas-entsyymi leikkaa DNA:n poikki opas-RNA:n osoittamista paikoista

• opasRNA on 20 nukleotidia pitkä (riittää kaikkien ihmisen geenien tunnistamiseen
• voidaan hyödyntää geeninsiirrossa sekä pienemmissä geenien muokkauksissa

Question 28

mistä crispr/cas menetelmä on peräisin?

Answer 28

bakteereilta; niiden immunologinen muisti perustuu cas-entsyymin toimintaan; bakteerit tallentavat omaan perimäänsä paloja niitä infektoineiden virusten DNA:sta; nämä DNA pätkät toimivat opas-RNA:na, joka uuden infektion sattuessa johtaa viruksen perimän pilkkoutumiseen; näin virus ei pääse lisääntymään bakteerisoluissa

Question 29

kloonaus

Answer 29

molekyylien, solujen tai kokonaisten organismien kopioiden tuottamista, esim. DNAn monistaminen PCR:llä on kloonausta, samoin bakteeri- ja soluviljelmät

-kloonaus tyypillisesti tumansiirtotekniikalla

Question 30

kloonauksen (tumansiirron) vaiheet

Answer 30

1. munasolu luovuttajanaaralta, josta tuman poisto
2. kloonattavalta yksilöltä somaattisia soluja, joita soluviljelmässä kasvatuksen jälkeen viedään luovuttajanaaraan munasoluun mikroinjektiolla
3. sähköimpulssin avulla siirretty tuma ja munasolu saadaan yhdistymään -> yhdistelmän annetaan jakautua muutaman päivän
4. alkioita siirretään emoksi valitun naaraan kohtuun ja naarasta stimuloidaan hormoneilla

Question 31

eläinten kloonauksen haasteet (5kpl)

Answer 31

1. varhainen kuolema
2. heikentynyt elinkyky
3. eettisyys
4. kloonaustekniikoiden kalleus ja epävarmuus
5. epigenetiikka eli ympäristön vaikutus: onko klooni sittenkään sama?

Question 32

geenikirjastot

Answer 32

geenejä voidaan tallettaa esim. bakteerien plasmideihin (joko suoraan tumallisesta katkaistu DNA pala, tai l-RNA:t käännettynä vastin-DNAksi eli ei introneita tai säätelyalueita) -> nämä siirretään bakteeriviljelmään, joka säilötään -196C nestetypessä

Question 33

genomitietokanta

Answer 33

ihmisgenomin tiedon varastointi

Question 34

biopankki

Answer 34

= kokoelma erilaisia biologisia näytteitä ja niihin liittyvää tietoa

tarkemmin: kudos- ja DNA-näytteiden talletus, sekä esim. kyselylomakkeiden talletus, jolloin elämäntavoista kertovaa tietoa voidaan yhdistää geenitietoon ja näin selvittää tautien puhkeamiseen johtavia geenien ja ympäristön yhteisvaikutuksia

Question 35

koetin

Answer 35

lyhyt, yksijuosteinen merkkiaineella leimattu RNA- tai DNA-jakso, jonka avulla voidaan etsiä haluttuja emäsjaksoja perimästä

esim. DNA-sirulla olevia pätkiä

Question 36

miten haluttu DNA-sekvenssi voidaan poimia geenikirjastosta?

Answer 36

viljelmän päälle painetaan huokoinen kalvo, johon tarttuu bakteereja (tai hiivoja) -> solurakenteet hajotetaan ja DNA:n kaksoiskierre avataan emäskäsittelyllä -> kalvolle lisätään merkkiaineella leimattuja yksijuosteisia koettimia, jotka pariutuvat niissä pesäkkeissä, joissa haluttu geeni on -> kalvo värjäytyy ja osoittaa missä pesäkkeessä haluttu geeni on, jolloin haluttu pesäke eristetään jatkoon

Question 37

proteomiikka

Answer 37

proteiinien rakenteen, merkityksen yms selvittämistä tietokoneiden ja analyysilaitteiden avulla

Question 38

mitä ongelmia on proteiinien tuotannossa bakteereissa voi olla?

Answer 38

monimutkaisten proteiinien viimeistely: bakteereilta puuttuu solulimakalvostot ja golgin laite -> siksi monet ihmisen proteiinit eivät laskostu oikein bakteerisoluissa, tai niihin ei saada lisättyä proteiinin toiminnan kannalta olennaisia osia esim. hiilihydraatit

Question 39

bioreaktori/fermentori

Answer 39

“paikka/alusta” jossa kasvatusolosuhteita voidaan kontrolloida tarkasti (käytetään geneettisesti muokattujen bakteeri hiiva ja homekantojen kasvatukseen, tai esim jätevedenpuhdistuslaitos on myös bioreaktori)

Question 40

mainitse jokin tehokas eläinsolu jossa voi tuottaa proteiineja

Answer 40

perhosten toukkien solut: hyönteisiä infektoivan viruksen avulla saa siirrettyä geenejä, ja toukat tuottavat proteiineja lähes yhtä tehokkaasti kuin bakteerit