F6 - Heterolog ekspression og posttranslationelle modifikationer

Question 1

Hvad er et assay?

Answer 1

En analytisk procedure for kvalitativ vurdering eller kvantitativ måling af tilstedeværelse af X. Med et assay kan vi finde og renfremstille proteiner fra deres biologiske vært.

Question 2

Hvad er udfordringen med at gå fra DNA-sekvens til protein?

Answer 2

Nemt at afkode sekvensen. Men hvordan ser det reelt ud? Hvad gør det? Og hvordan gør det det?

Question 3

Hvad er heterolog ekspression?

Answer 3

Ekspression af et gen i en værtsorganisme.

Question 4

Hvad er homolog ekspression?

Answer 4

Ekspression af et gen i dets orginale organisme.

Question 5

Hvordan foregår kloning?

Answer 5

Vektor + eukaryot kromosom –kløvning–> Splittet op –Ligase–> Danner vektor –Indsættes i værts celle–> Mange kan klones.

Question 6

Hvor kan en vektor komme fra ved kloning?

Answer 6

Kan være syntetiseret DNA-sekvens man har fundet via digtialinformation ELLER en forproduceret vektor, hvor et syntetisk gen er indsat i en passende vektor.

Question 7

Hvad skal en vektor indeholde ved heterolog ekspression? (5 ting)

Answer 7

1. Ori = Origin of replucation(Får vektoren til at blive i værtsorganimsne. Udbreder ligeledes plasmidet ved celledeling)
2. Promoter = Hvad skal transkriptionen starte og stoppe. DNA –> mRNA.
3. Ribosom binding sites = Translationen i ribosomerne. mRNA —> Protein.
4. Ønsket DNA-sekvens = Opskriften på den AA vi vil udtrykke.
5. Selektionsmarkør = Tag til genkendelse inden oprensning. (fx. GFP)

Question 8

Hvilke overvejelser udfordringer er det ved heterolog ekspression? (4 punkter)

Answer 8

1. Kompartmentalisering mangler
2. Kun i reducerede miljøer (i cytosolen. INGEN disulfidbindinger)
3. Mangler sekretoriske proteiner
4. Mangler betingelser der sikre essentielle PTMer der giver proteinet dets rette egenskaber og foldning.

Question 9

Hvordan anvendes antistoffer? (Kaninslide)

Answer 9

Antigen injecteres i fx kanin. Danner antistoffer mod antigenet –> Serum dannes med de specifikke antistoffer. Serum udtages (fx. blod). —> Antistoffet kan nu bruges til: 1. Immunudfældning. 2. Immuno-/westerblot. 3. Affinitetskromatografi.

Question 10

Hvad er et antistof? Hvordan ser det ud? Hvilke interaktioner laver det?

Answer 10

Ofte et IgG. Y-struktur. Har en Hinge-region = fleksibel del. Kan klippes fra hinanden og udtrykkes hver sig(domæner). Har et antigenbindingssite på dens “arme”, altså kan IgG-domænet for armene differentieres meget. Disulfider får den til at hænge sammen. Laver protein-protein interaktioner. (I har selv en god tegning ikke ligesom)

Question 11

Hvad er posttranstionelle modifikationer? Hvad afhænger de af?

Answer 11

Hvad proteiner modificeres efter. Kovalente ændringer i proteinets struktur EFTER translation. Afhænger af cellulære betingelser og chaperoner.

Question 12

Hvad er transkription?

Answer 12

Fra DNA til RNA

Question 13

Hvad er translation?

Answer 13

RNA til peptidkæde

Question 14

Hvor forekommer der flest PTMer? (af gær, bakterier og højere eukaryote organismer)

Answer 14

Jo mere komples organimse, jo flere PTMer.

Bakterier < Gær < højere eukaryot

Question 15

Hvad består det sekretoriske system af?

Answer 15

ER, Golgi, Endosomer, lyosomer, transport vesikler og cellens overflade.

Question 16

Hvad er et signalpeptid? Hvad gør de ved proteiner?

Answer 16

Et kort peptid, der er til stede ved N-terminalen af ​​hovedparten af ​​de nyligt syntetiserede proteiner, der er bestemt til at gå den sekretoriske vej. Dirrigerer proteiner ind i ER = proteintranslation ind i ER, hvor signalpeptidet spaltes under PTMer.

Question 17

Hvor langt(antal aa) er et signalpeptid? Hvor mange hydrofobe aminosyrer er der?

Answer 17

17-25 aa langt. Hydofobe del er 10-15 aa langt.

1 og 3 skal være hydrofobe+neutrale!

Question 18

Nævn fire forskellige PTMer

Answer 18

1. N- og O glykolysering
2. Disulfidbroer
3. Phosporyleringer
4. Zymogener(kløvning)

Question 19

Hvilke egenskaber har en N-glykolysering?

Answer 19

Hydrofil, dynasmisk og omfangsrig. Kan sige noget om lokalisering i cellen. Præsenteres på overfladen af membranen med et bindingssites

Question 20

Hvor sker N-glykolysering?

Answer 20

Kun i ER, modificeres færdigt i golgi.

Question 21

Hvor sker O-glykolysering?

Answer 21

Kun i golgi

Question 22

Hvad er aminosyresekvensen for N-glykolysering?

Hvilken aminosyre er essentiel?

Answer 22

Asn-Xaa-Thr. Asn, da den laver N-bindingen til oligosakkaridet(sukkeret)

Question 23

Hvad er aminosyresekvensen for O-glykolysering? Hvilken aminosyre er essentiel?

Answer 23

Asn-Xaa-Ser. Ser, da den laver O-bindingen til oligosakkaridet(sukkeret)

Question 24

Hvordan fungerer en disulfidbro? (Hvordan ser den ud i cytosol vs. i ER/resten?)

Answer 24

Cytosol = Reduceret, SH SH = Ingen bro
ER/resten = Oxidereret, S-S = Bro

Question 25

Hvad er en DTT?

Answer 25

En bestemt PTM. Fosforylere. Vigtig for signaltransduktion. Ødelægger disulfidbroer.

Question 26

Hvad skal vi overveje når vi laver heterolog ekspression? (5 punkter)

Answer 26

1. Bakterie eller eukaryot celle? (PTMer sker ikke i bakterier, da det ikke har nogen ER.)
2. I cytosol eller sekretorisk? (Disulfider og glykolysering kan ikke dannes i cytosol)
3. Hvilke PTM’er og Co-faktorer er ellers essentielle for mit protein.
4. Protein foldning og stabilitet.
5. Interaktionspartnere.

Question 27

Hvilke fordel og ulemper er der ved et tag?

Answer 27

Fordele: Ses med det blotte øje. Både på celleplan og molekylært plan.
Ulemper: Kan binde sig til andet evt så andet end det søgte kommer til udtryk. Kan påvirke genet, fordi det bliver transkriberet sammen med “Peters gen”.