F5 - Strukturbestemmelse- og analyse. Spektroskopi(NMR, CryoEM og Krystalografi)

Question 1

Hvad er sammenhængen mellem bølgelængde og energi?

Answer 1

Jo kortere bølgelængde, desto højere energi.

Jo længere bølgelængde, desto lavere energi.

Question 2

Kan aminosyrer absorbere lys?

Answer 2

Ja, de absorberer lys ved forskellige bølgelængde.

Question 3

Hvorfor måler man lysabsorbtion?

Answer 3

For at identificerer molekyler samt deres koncentration i en solution.

Question 4

Hvad er lambert beers lov givet ved? Hvad er der en sammenhæng mellem i denne formel?

Answer 4

Absorbans = Epsilon * koncentration af solution * længde(af kuvetten)
Sammenhæng mellem prøvens koncentration og lysabsorbtion(Som er basis for mange analytiske anvendelser)

Question 5

Ved hvilke bølgelængder(absorbtion af lys) absorberer peptidbindinger?

Answer 5

Stærkest ved 190nm. Svagest ved 210-220nm.

Question 6

Ved hvilke bølgelængder absorberer Phe, Tyr og Trp?

Answer 6

hhv. 257nm, 274nm og 296nm.

Question 7

Ved hvilke bølgelængder fluorescerer Phe, Tyr og Trp?

Answer 7

hhv. 282nm, 303nm og 348nm

Question 8

Hvilke kromoforer har proteiner? (Hvad er en kromofor?)

Answer 8

Phenylanalin, Tyrosin og Tryptofan.

Kromoforer = En gruppe af atomer der absorberer lys i den synlige område, som er fra 300-700nm

Question 9

Hvad afhænger absorbtionen af?

Answer 9

Antallet af molekyler der kan absorbere lys.

Question 10

Hvad er en fejlkilde i lambert beers lov? Hvordan virker den bedst?

Answer 10

Antager at alle molekyler bidrager til absorbtionen, og at der ikke er nogen molekyler der skygger for andre. Virker bedst ved små koncentrationer.

Question 11

Hvad kan almen spektroskopi IKKE bruges til?

Answer 11

Kan ikke bruges til at bestemme strukturer. Kan kun sige noget om interaktioner, dynamik og placering.

Question 12

Hvad er fluorecens? Hvornår udvises det?

Answer 12

Form for luminiscens, hvor et stof optager energi i form af stråling og genundsender energien som synligt lys. Når molekylet går fra den exciterede(optaget photon) tilstand tilbage til grundtilstanden.

Question 13

Hvad er et stokes skift?

Answer 13

Energiforskellen mellen den laveste energi-absorbtionstop og den højeste energi emissionstop.

Question 14

Hvad er excitation?

Answer 14

Et molekyle der optaget en photon bliver exciteret. Hvad man fyrer ind af lys er excitationen.

Question 15

Hvad er emission?

Answer 15

Et molekyle der afgiver den photon den optog. Lys bliver emitteret. Hvad der kommer ud af bølgelængde er emmisionen.

Question 16

Hvad er en fluorofor?

Answer 16

En kromofor der udsender fotoner er en flurofor, og det udsendte lys er fluorescens. Afgiver fluorescens ved forskelige påvirkninger fx. elektroner, ultravioletlys eller kortbølget synligt lys. Eller ved små, store og/eller komplekse forbindelser.

Question 17

Nævn to fluroforer.

Answer 17

Fx tryptofan eller GFP.

Question 18

Hvad er quenching? Hvad quencher tryptofan?

Answer 18

Alle de processer der får emissionen til at falde. Alle polære grupper quencher tryptofan inkl disulfider.

Question 19

Hvad er fluorescens maximum for hhv foldede og udfoldede proteiner?

Answer 19

335nm og 356nm.

Question 20

Hvad afhænger fluorescensmekanismen af?

Answer 20

Det kemiske miljø.

Question 21

Hvad er quantum yield?

Answer 21

Hvor meget af det absorberede lys der udsender fluorescens.

Question 22

Hvad kan FRET bruges til?

Answer 22

Til at studere molekylære interaktioner i levende celler. Fx. protein-protein interaktioner eller ligandbinding til receptro.

Question 23

Hvilke to betingelser er nødvendige ved FRET? Hvornår udvises FRET?

Answer 23

1. To proteiner skal være tagget med to forskellige fluroforer, hvor emmisionen af den ene flurofor skal overlappe excitationen af den anden flurofor.
2. Afstanden er essentiel. De må ikke være længere end max 10 nm(100 Å) fra hinanden, ellers udveksler de ikke energi.
   FRET udvises kun hvis de to taggede molekyler interagerer ellers vil der ikke ske noget.

Question 24

Hvad er CD-spektroskopi og hvad kan det bruges til?

Tegn et karakteristisk CD-spektrum.

Answer 24

Udnytter proteiners chiralitet, hvor hver sekunddær struktur har deres eget karakteristiske spektrum når det bliver udsat for cirkulært lys.
Kan bruges til 1) at bestemme overordnede sekunddære strukturer. 2) Vurdere protein foldet vs. udfoldet. 3) Strukturelle ændringer ved ligand/ion tilsætning eller ved pH, temp eller solvent ændring.

(Husk ved tegning de forskelige sekunddærers struktur minimum og maximum)

Question 25

Hvilke avancerede spektroskopi metoder bruges til strukturbestemmelse?

Answer 25

X-ray krystalografi, NMR og Cryo-EM.

Question 26

Hvilke formål har krystalografi? Hvordan foregår den strukturelle analyse?

Answer 26

Bestemme struktur via krystalisering. Sætte røngtenstråler gennem krystallen(diffraktionsprincippet), så de generer et difraktionsmønster. Mønsteret repræsenterer elektrontætheden. Konvertere data til elektrontæthedskort via Fourrier transformation. Spore backbone ved at vurdere om proteinsekvensen fitter til kortet.

Question 27

Hvad vurderes x-ray krystalografi udfra?

Answer 27

R-faktor, B-faktor, Ramachandranplot og resolution.

Question 28

Hvad generer NMR? Hvad skaber NMR-linjerne?

Answer 28

Spin og eller spin ned af kernen fra grundtilstanden. Forskellen fra spinnet til grundtilstanden er det kemiske skift som generer NMR-linjerne. Peaksene i diagrammerne er altså de kemiske skift.

Question 29

Hvad er de kemiske skift(peaksene) i NMR et resuktat af?

Hvilke kerne måler man på i NMR? Hvad er enheden for peaksene?

Answer 29

Hvor godt en kerne er afskærmet med elektroner, da dette påvirker absorbtionen. Det kemiske miljø påvirker altså de kemiske skift.
Primært isotop-H-1. Indmærker med C-13 og N-15 kerner.
Peaksene er også et udtryk for antal H-atomer.
PPM er enheden.

Question 30

Hvilke tre faktorer skal peaksene i NMR aflæses med?

Answer 30

1. Kemiske skift (Det kemiske miljø –> Elektronegativiteten –> Downfield og upfield).
2. Intensiteter.
3. Opsplitningsmønster.

Question 31

Når kernerne i proteiner/molekyler gennemsnitligt ser det samme miljø hvad betyder det for de kemiske skift?

Answer 31

Deres kemiske skift(peaks) bliver mere ens.

Færre streger der er mere ens + prikkerne mere lodret, mere afgrænsede

Question 32

Hvad vil der ske ved NMR-spektroskopi af et protein?

Answer 32

Vil komme med et karakterisktisk spektrum, hvor der på forhånd er opgivet PPM-værdier for specielle funktionelle grupper, som kan aflæses.

Question 33

Hvad er en tilordningsproces ved NMR?

Answer 33

Bruger et specifikt sæt af NMR-spektre(fx. COSY, NOESY). For HSQc-spektrum kommer det ud som et form for “todimensionelt”-diagram med prikker, hvor H-kerner er på x-aksen og N-kerner på y-aksen. Repræsenterer så en binding mellem de to kerner. Der er karakteristiske peaks for forskellige sidekæder. Foldet protein vil fremkomme meget bredt(ppm fra 10-7), og udfoldet protein meget mere lodret(ppm fra 9-8).

Question 34

Hvad er afstandbegrænsninger i NMR?

Answer 34

Restraints. Bruges til at beregne strukturen. Vurderer hvem der sidder i nærheden af hinanden. Mest bruge restraints er NOE’er(kommer fra NOESY-spektrum). Hver plet i et 2D-NOESY spektrum svarer til ét par H-atomer, hvis afstand er mindre end 5 Å(Som så er dipol-dipol vekselvirkninger, r-6, kortrækkende).

Question 35

Hvad er en NMR struktur egentligt? Én eller flere strukturer?

Answer 35

Flere strukturer, hvor man har kørt mange forskellige, restraints, tilordningsprocesser( osv) på proteiner, og samlet alle data i et computerprogram. Kan være 10-20 strukturer i én gennemsnitlig struktur.

Question 36

Hvad er Cryo-EM?

Answer 36

Billeddannelse via elektroner.

Question 37

Hvad vurderes NMR-strukturer udfra?

Answer 37

Rmsd, Violations af afstands restraints og ramachandran plot.

Question 38

Hvad betyder elektronegativiteten for NMR-målingen?

Answer 38

Hvor peaksene vil komme til udtryk på grafen.
Upfield = Høj elektronegativitet, H er mindre afskærmet, høj ppm.
Downfiels = Lav EN, H er mere afskræmet, lav ppm.

Question 39

Forklar faseproblemet for krystalografi.

Answer 39

Den eneste oplysningen man ikke har fra krystalografien. Man har absorbansen, amplituden. Mangler fasen.