F10 - Proteinfoldning og stabilitet Flashcards
Hvad siger Anfinsens dogme?
Sekvensen koder for strukturen.
Hvad er denaturering?
Et tab af 3D-strukturen, og fald af funktion.
Hvad kan få et protein til at denaturere? (5 punkter)
- Varme. 2. Ekstreme pHer(under 5, over 10). 3. Solventer fx. alkohol. 4. Detergenter(sæbe-ish) 5. Chaotroper(Urea og Guanidinium chlorid) (Bonus: SDS er også en denaturant)
Hvordan fungerer Urea som denaturant/chaotrop?
Ødelægger den hydrofobe aggregering af ikke-polære aa der laver den stabile kerne samt ødelægge hydrogenbindinger.
Hvordan adskiller Urea og Guanidinium Chlorid sig fra hindanen? Og hvad er der ens ved dem=
Urea er uladet, mere svag. Guanidinium Chlorid er ladet, mere stærk. De udfolder proteiner forskelligt. Har forskellige D50(Cm)-værdier, men SAMME hældning af deltaG plottet(m-værdi) dvs. ens stabilitet af det udfoldede protein. rne
Hvorfor vil vi gerne denaturere proteiner?
Kan studere proteinstabilitet ved at destabilisere proteinet. Udfolder proteinet for at studere dets stabilitet.
Hvad er chaotropers funktioner?
Destabilisere proteiner ved at udfolde det. Interferer med proteinet vekselvirkninger. Dvs. gøre det stabilt i den udfoldede tilstand.
Ved ligevægten Foldet Udfoldet hvad siger deltaGu og Keq så noget om for proteinet uden denaturant?
Ligevægt forskudt mod venstre. Keq er mindre end 1. DeltaGu er større end 0.
Ved ligevægten Foldet Udfoldet hvad siger deltaGu og Keq så noget om for proteinet med denaturant?
Ligevægten forskudt mod højre. Keq er større end 1. DeltaGu er mindre end 0(LAV DELTA G ER GODT).
Hvad er formlen for deltaGunfolded?
DeltaGu = -RTln(Keq), Kep = U/F
Ved ligevægten udfoldet Foldet er deltaG negativ med 10mm denaturant. Er proteinet foldet eller ikke?
Foldet. (Ligevægten er alt)
Ved ligevægten Foldet Udfoldet er deltaG negativ med 10mm denaturant. Er proteinet foldet eller ikke?
Udfoldet. (Ligevægten er alt)
Hvad er givet når deltaG med 0 for proteines foldning?
Der er lige meget foldet og udfoldet protein.
Hvad er deltaG når Kep = 1?
DeltaG = 0. Der er lige meget foldet og udfoldet protein.
Hvad er formlen for fraction folded?
(F) / ((F) + (U)) (Ofte y-aksen på grafen)
Hvilken kurve er ved fraction udfoldet over Denaturant-koncentration?
S-kurve
Hvilken kurve er ved fraction foldet over Denaturant-koncentration?
Omvendt s-kurve.
Hvad er D50 eller Cm?
Når deltaG=0. Fraction 0,5. 50% af hver foldning.
Hvad er sammenhængen mellem hældning(m) og Cm på grafen for deltaG over Denaturant koncentration?
Hældning og Vm kan være forskellige. Begge er afgørende for stabiliteten.
Hvad er givet når Denaturenatkoncentration = 0?
Det er “normal-tilstanden” for proteinet. Der hvor det er foldet uden denaturant.
Ved lav denaturantkoncentration hvad så?
Høj deltaG = foldet = normal tilstanden for proteinet uden denaturant. Ikke favorabelt når denaturanten først er tilsat.
Ved høj denaturantkoncentration hvad så?
Lav deltaG = Udfoldet = godt med denaturant.
Hvad er deltaGunfolded givet ved når man siger deltaG vs. denaturantkoncentration?
deltaGu = DeltaG(H20)-m*molær koncentration af denaturant.
Hvad kan tryptrofan fluorescens bruges til ved proteinstabilitet?
Vi bruger fluorescensintensitet ved en bestemt bølgelængde til at måle graden af udfoldning. Jo mere udfoldet, jo mere blottet tryptofan, jo højere fluorecens ved bølgelænge på 320 nm.
Hvad siger Levinthals paradox?
Alle proteiner kan ikke nå at afsøge alle foldningsmuligheder. Det vil tage 10^27 år. Der er for mange muligheder. Konklusion: Proteinfoldningen er dirigeret af bestemte foldningsveje.
Hvad er en foldningstragt?
En termodynamisk og komprimeret måde at se foldningsmulighederne på.
Følger proteiner altid den samme rute i foldningstragten?
Nej. Den udfoldede tilstand er aldrig ens. Tænk på en golfspiller –> Kan lande forskellige steder i foldningstragten, men ender altid i bunden af tragten —> ender i samme foldede tilstand.
Hvad betyder de små toppe i foldningstragten?
Forhindringer, hvor aktiveringsenergien hæves, som nedsætter foldningshastigheden.
Hvad er aggregering? Hvilke områder eksponeres og hvorfor er det skod? Ved hvilke koncentrationer sker aggregering?
Samling/ophobning af molekyler. Hydrofobe områder eksponeres ved foldning, som skaber aggregering og det er bare dead-end. Sker især ved høje koncentration.
Man kan sætte spørgsmålstegn ved Anfinsens dogme, da han lavede hans forsøg in vitro. Hvorfor kan man det?
In vitro er i reagensglas. Det er ved lave koncentrationer = der er masser af plads for proteinerne.
In vivo er i cellen. Der er lidt plads/mast, så koncentrationen føles høj. Dette skaber aggregering :(
Hvad modvirker aggregering?
Chaperoner
Hvad er chaperoner? Hvordan virker de?
Proteiner der integerer med foldede og udfoldede polypeptider, så de folder korrekt. Binder hydrofobe dele af proteinet. Men kan også genkende proteiner der skal dø.
Hvad kendetegner HSP70? (7 punkter).
- Chaperon(Forhindrer præmatur foldning). 2. Binder v. hydrofob eksponering. 3. Når substratet binder så folder det ikke. 4. ATP-afhængig via hydrolyse. 5. Åben form = høj affinitet, lukket form = lav affinitet. 6. Fanger intemediater, som får chance for mere korrekt foldning. 7. Til stede når celler er stressede af høj temperatur.
Hvad kendetegner GroE? (8 punkter)
- Chaperonin(Hjælper til korrekt foldning). 2. Binder v. hydrofob eksponering. 3. Folder i lukket rum/kammer, så aggregering undgås. 4. ATP-afhængig via hydrolyse. 5. Stammer fra bakterier. 6. Kammeret er hydrofobt = substratet binder. 7. Ved åbent kammer kommer s ind. Lukket kammer s-folder korrekt. 8. Kan påvirke foldetragten.
Hvad kan chaperoner ikke? Og hvad kan de kun?
Kan ikke ændre på den endelige struktur. Kan kun folde proteiner der er stabile i den foldede tilstand.
Hvad er amyloider?
Aggreater af proteiner. Misfoldede. Disfunktion af chaperoner giver amyloider. Ofte sygdomsrelateret. Kendetegnet ved amyloid fibriler, som er fibre af beta-strukturer.
Hvad betyder det når Hillkoeffienten fx er 3,6?
Postiv kooperativtivt. Der er minimum 4 bindingsites.
Hvis vi tænker på et hill plot for et enzym med flere bindingssites. Hvad viser s-grafen så før, på og efter knækket af grafen?
Før = Affinitet for bindingsite På = Ændring i affinitet Efter = Ny affinitet efter ændring
Hvordan kan vi finde amyloider?
Ved fluorescens. Thioflavin binder til amyloider. Ved amyloider binder thioflavnin = fluorescerer . Ingen binding, ingen fluoresces.
Hvad er random coil?
Fuldstændig tilfældig udfoldet kæde.
Hvad er molten glubole?
Et intermediat i foldningsprocessen.
Udfoldet(Denatureret) –> I (Molten glubole) –> Nativ form
