F2 - Sekundærstruktur. Proteinoprensning og - karakterisering Flashcards
Hvilke tre slags overordnede sekundærestrukturer findes der?
Alfa-helix, Beta-shetts og beta-turns.
Hvilke 6 effekter stabiliserer en alfa helix?
- Begravelse af den hydrofobe form.
- Interaktioner med helix dipolen
- Hovedkæde-interaktionerne
- Helix-capping
- Solvatisering af ikke-bundne H-donor og -acceptorer.
- Van der Waals interaktioner
Hvilke alfa-helixer er mest almindelig? (Højre eller venstrehåndet?)
Højre
Hvor langt(i Å) er ét single turn i en alfa-helix?
5,4 Å
Hvor mange aa-rester består ét single-turn af?
3,6 rester
Når man tager single-turn pr. aa-rester i en alfahelix hvad får man så? Og hvad kan dette tal bruges til? Kom med et eksempel på en udregning.
5,4 Å / 3,6 aa giver 1,5 Å pr. aminosyrerest. Kan bruges til at måle længden af en alfa-helix. Fx. ved 80 AA i en alfa-helix er længden = 80 rester X 1,5 Å/rester = 120 Å.
Nævn rækkefølgen af funktionelle grupper i en alfa-helix når man kigger på backbone.
Aminogruppe - C-atom med r-gruppen - C-atom med dobbeltbundet O atom(carboxylgruppen).
Hvilke signifikante bindinger giver alfa-helixen dens form? Og mellem hvilke atomer?
Hydrogenbindinger mellem carboxylgruppens dobbeltbunde O og H-atomet på aminogruppen.
Er det lige meget hvilke aminosyrer der er i en alfahelix?
lang svar ikke bare ja/nej
Nej, da det gælder at hvilke aa der er i helixen kan påvirke strukturen. Nogen aa er bedre end andre samt nogen foretrækker at være udfoldet ved bestemt pH eller bliver pro-/deprotoniseret ved forskellige pH. Kan dog også stabilisere alfa-helixen.
Hvilke aa er gode alfahelix dannere?
Alanin(A), Leucin(L), Methionin(M), Phenylalanin(F), Glutamat(E), Glutamin(Q), Histidin(H), Lysin(K), Arginin(R). Bl.a pga “forlænget” struktur så der er plads til sidekæderne.
Hvilke aa er gode kernedannere?
Alanin(A), Valin(V), Leucin(L), Isoleucin(I).
Hvorfor er Glycin dårlig i en alfahelix til trods for den er så lille?
Den har stor hovedkædefleksibilitet, og favoriserer ofte den udfoldede tilstand.
Hvilke er dårlig alfa-helix dannere?
Tyrosin(Y), Tryptofan(W), (Phenylalanin og Methionin også lidt). Pga. de er så store = sterisk hindring
Isoleucin(I), Valin(V) og Threonin(T). Pga forgrenet på på beta-carbon.
Hvad gør Prolin for en alfahelix?
Bryder hydrogenbindingsmønsteret og dermed “knækker” alfa-helixen pga cis-konfiguration. (De andre er trans).
Hvad betyder det der er en helix dipol i alfa-helixen?
Den er vigtig for stabilisering. N-terminalen er positivt ladet og c-terminalen er negativt ladet. Dette danner en en elektrisk dipol i peptidbindingerne, som giver en netto-dipol for alfahelix.
Hvor er alfa-helix oftes placeret på et protein?
Ofte placeret på ydersiden, så den hydrofobe del er vendt mod solventet og den hydrofile del mod proteinet. De ladede N- og C-teminaler er begge på samme side mod proteinet.
Hvad betyder helix-capping?
Første turn indgår ikke i H-bindingsmønsteret, fordi sidekæderne, eller H2O, binder de 4 første N-atomer og de sidste 4 C-atomer som hhv NH og C=O.
Hvilke tre effekter består en super alfa-helix af?
- Alfa-helix capping. 2. Stabilisering af dipolen. 3. Ioniske interaktioner mellem AA’erne på samme side.
Hvilke to typer b-sheets findes der? Og hvor lange er de?
Parallele(3,4 Å pr AA, 7 Å pr. periode) og anti-parallele(3,2 Å pr AA, 6,5 Å pr. periode)
Hvad er én periode i en peptidkæde?
Fra én aminogruppen til og med det andet c-atom med et dobbeltbundne O. “To aminosyrerester” (AA –> AA)
Hvilken er mest stabil af de to typer B-sheets der findes?
Antiparallel
Er hydrogenbindingerne “skæve” eller lige i en anitparallel b-foldebladstruktur?
Lige.
Hvad stabiliseres en B-sheets af?
Hydrogenbindinger og hydrofobe interaktioner mellem sidekæderne.
Hvad kan NH og CO bindes til/via i yderstrengene af B-sheets?
Hydrogenbindinger til solventet eller hydrogenbindinger til polære sidekæder.
Hvad er et mixed B-sheet?
To yderstrenge fra B-sheet i forskellige proteinkæder hydrogenbinder til hinanden i et protein-protein interface. Dette stabiliserer komplekset.
Hvad er en beta-barrel?
En supersekundær struktur. B-sheet der danner en “tønde”(hulrum/hul i midten). De yderste strenge hydrogenbindier til hinanden.
Hvad kan der være i midten af en beta-barrel?
Kan have en “pære” i midten der kan udsende fluorescerende lys.
Hvilke AA ses ofte i B-sheets? Og hvorfor?
Valin(V), Isoleucin(I) og Tryptofan(W). Alle er relativt hydrofobe mellem de andre beta-streng. Laver hydrofobe vekselvirkning.
Hvad et et B-turns funktion? Er de almindelige i proteiner?
Forbinde Alfa-helix og B-sheet, samt forbind antiparallel-sturuktur B-sheet struktur. Meget almindelige i proteiner.
Hvilken vinkel laver B-turn og med hvor mange aminosyrer indgår? Hvilken binding laver disse aminosyrer?
Danner 180 graders vinkel med 4 aminosyrer. Laver hydrogenbinding mellem AA 1(COO-) og 4(NH3+).
Hvilke AA er ofte forekommende i B-turn?
Glycin(Lille og fleksibel) og Prolin(Tillader Cis-konfi).
Hvor sidder B-turns ofte i proteiner?
Overfladen, hvor AA på 2 og 3s plads kan lave hydrogenbindinger med vand.
Hvilke typer af B-turns findes der? Og hvilken er mest almindelig?
Type I og type II. Type I er mest almindelige(Ofte med prolin i position 2. Type II er Prolin også almindelig, men her sidder Glycin i 75% af tilfældende i position 3)
Hvad kaldes de vinkler vi kan se i en peptidkæde samt hvor sidder de?
Psi(trefork) mellem C-alfa og carboxylgruppen.
Phi(Ø) mellem C-alfa og aminogruppen.
Mellem hvilke to grupper i en peptidkæde kan ikke roteres?
Carboxylgruppen og aminogruppen.
Hvilke teoretiske vinkelmuligheder er der i en peptidkæde mellem Psi og Phi-vinklerne?
180 graders fridejelighed(både + og - af grader)
Hvad er de idelle phi og psi vinkler for en alfa-helix? Hvad kan påvirke drejeligheden?
Phi-vinkel: -57 grader
Psi-vinkel: -47
R-grupperne kan påvirke drejeligheden.
Hvad er de idelle phi og psi vinkler for B-sheetsene?
Antiparallel = Phi-vinkel: -139 Psi-vinkel: +135 Parallel = Phi-vinkel: -119 Psi-vinkel: +113
Hvad kan en supersekundær struktur være svær at skelne fra?
En kvartenær struktur.
Hvad er en supersekunddærstruktur?
Et stabilt foldningsmønster for de fire typer af sekunddærstruktur(Helix, turn, loop, beta-sheet). Også kaldet et motiv eller et fold.
Hvad kan et domæne beskrives udfra?
Sit fold eller motiv.
Hvad bestemmer hvad når man tager en AA-sekvens vs. fold?
Sekvensen bestemmer foldet, foldet bestemmer strukturen.
Nævn tre supersekundære strukturer? Tegn evt.
- Beta-Alfa-Beta-loop. 2. Alfa-alfa-corner. 3. Beta-barrel.
Hvad kan de supersekundære strukturer gøre der er genialt når vi snakker hydrofobitet?
Begrave de hydrofobe AA ved at “pakke” de sekundære strukturer.
Hvad betyder det at “Små motiver kan bidrage til store motiver” i en supersekunddær struktur?
Små dele af en supersekunddærstruktur/fold kan tages ud og studeres fra den store struktur. MEN det er stadigvæk en supersekunddærstruktur.
Hvad er der egentlig misvisende ved ordet “supersekunddærstruktur”?
Det får hierakisk ordlyd. Som om det er “bedre/større” end en sekunddærstruktur.
Hvad er et domæne?
En del af en polypeptidkæde der “independent” stabil, som kan tages ud af hele proteinet og stadigvæk bevare sin funktion. Et domæne kan beskrives udfra sit fold.
Når vi snakker domæner hvad er så mest almindeligt med antal i store og små proteiner?
Store proteiner har ofte flere domæner. Små proteiner har ofte kun ét domæne(Domænet ER proteinet).
Hvad er et modul?
Indeholder mange gentagende kopier af ét eller flere domæner på samme polypeptid. Proteindomæner er et alfabet af funktionelle moduler.
Hvilke fire regler er gældende for proteiners fold/motiver?
- Den hydrofobe effekt stabiliserer proteinet.
- Når alfa-helixer og b-sheets er i samme protein findes de ofte i forskellige strukturelle lag.
- Segmenter tilstøder til hinanden i AA-sekvensen hvor de almindeligvis er pakket tilstødende til hinanden i den foldede struktur.
- Beta-konformationer er ofte mest stabilie når deres individuelle segementer er drejet en smule i højrehåndet retning.
(Se side. 137)
Hvilke sekundærer og supersekundærer struktur findes der mest af?
Mest alfa-helix. Meget B-sheet. Dernæst meget
alfa-B-Alfa.
Hvilke tre overvejelser skal man spørge sig selv om når man skal oprense et protein?
- Hvad skal det bruges til?(Enzymkinetik eller medicin?)
- Hvilken kilde skal benyttes?(Naturlig eller rekombinant?)
- Hvilke metoder er tilgængelige?
Hvilke 6 fysiske og kemiske egenskaber udnytter vi i søljekromatografi og elektroforese?
- Størrelse og facon på proteinet.
- Ladning og ladningsfordelning af proteinet.
- pI-værdien.
- Opløsligheden(pH-afhæninghed, ionstyrke, iontype, polarisering).
- Hydrofobitet
- Affinitet med ligand, DNA og metalioner.
Vi står med en organisme i hånden. Hvilke tre forberedende trin skal der til før proteinoprensning og karakterisering?
- Bryde/åbne celler så proteinet bliver tilgængeligt(Crude ekstrat)
- Fraktionere (Adskille stofblandinger i flere dele) og evt. tilføje salt.
- Evt. dialyse(Udnytte semipermable membraner til at gøre proteinet mere rent)
Hvordan fungerer søjlekromatografi? (Hvad kan det undersøge? Hvilke faser er der i søjlen? Hvad danner den i søjlen?)
Kan undersøge forskellige egenskaber: Ladning, størrelse, affinitet fx.
En mobilfase(proteinet) og en stationærfase(matrix, det solide der er i søjlen).
Laver forskellige bånd(vandrer hurtigere eller langsommere) afhængigt af hvilke egenskaber proteinet har og hvad der undersøges for.
Hvad udnytter ionbytter søjlekromatografi?
Hvad er søjlen ved hhv Cation-exchange og Anion-exchange?
Udnytter forskellige ladninger ved en given pH.
Søjlen er ladet.
Cation = Negativ ladet søjle (POSTIV eluerer langsomst –> binder til søjlen)
Anion = Postitiv ladet søjle (NEGATIV eluerer langsomst)
Hvad er sammenhæng mellem pI-værdier, en anion-exhange søjlekromatogrfi og NaCl-koncentration?
Jo lavere pI-værdi for proteinet jo mere NaCl-koncentration skal der til for at eluere proteinet.
Hvilke fire søjlekromatografier findes der?
Ionbytter, gelfiltrering, affinitet og GST affinity tag.
Hvad er HPLC (Søjlekromatografi)?
Kromatografi-metoder forbedres ofte ved brug af HPLC(Trykpumpe. En maskine), som øger hastigheden for molekylerne langs søjlen.
Hvilke tre gelelektroforeser findes der til proteinkarakteristik?
SDS-page, pI-fokusering og 2D-elektroforese(blandning af SDS og pI)
Hvad løber proteinerne mod i en SDS-page? Og hvordan eluerer de ifht størrelse?
Mod den postive ende. Små proteiner bevæger sig hurtigere i gelen, og negative bevæger sig ligesådan hurtigere mod den positive ende af gelen. Da SDS-pagen er negativ.
Forklar hvorfor Ala, Leu og Glu forekommer forholdsvist hyppigt i alfa-helix.
- Ala er den mest uskyldige aminosyre. Den har ingen tab i energi når den binder sig i en alfa-helix. Meget små i stuktur/r-grupper.
- Leu den er hydrofob, bidrager til den hydrofobe kerne. Stor fleksibilitet i sidekæden. Kæden sidder på gamma-carbon.
- Glutamats carboxylsyre sidder længere ude, og gør der er mindre sterisk hindring. Den er mindre ”bulky”. Den er bedre end aspartat.
