DOLCI - 4) Gammopatie Monoclonali Flashcards
Quali sono le CARATTERSITICHE fondamentali della STRUTTURA delle PROTEINE?
Le CARATTERISTICHE fondamentali della STRUTTURA delle PROTEINE sono:
- Formate da una SEQUENZA di AA uniti da LEGAMI PEPTIDICI, tra gruppo AMMINICO (-NH2) e gruppo CARBOSSILICO (-COOH) di vari AA
- si ha una ESTREMITA AMMINO-terminale e una CARBOSSI-terminale
- le proteine sono quindi molecole ANFOTERE –> possono comportarsi sia da ACIDO che da BASE
a seconda del pH dell’AMBIENTE - Il PUNTO ISOELETTRICO (pI) è il pH a cui la proteina ha CARICA NETTA = 0
Cosa si intende per proprietà ANFOTERA delle proteine e come influenza il loro comportamento in un CAMPO ELETTRICO elettrico?
La PROPRIETA’ ANFOTERA delle PROTEINE si riferisce alla loro capacità di comportarsi sia da acido che da base
–> INFLUENZA il loro comportamento in un CAMPO ELETTRICO:
- Se pH SOLUZIONE è > del punto isoelettrico (pI) della proteina, questa perde protoni (si carica NEGATIVAMENTE) e va verso il POLO POSITIVO (Anodo)
- Se il pH SOLUZIONE è <del pI, acquista protoni (si carica POSITIVAMENTE) e migrerà verso il catodo (POLO NEGATIVO)
NB: la differenza tra i due pH determina l’INTENSITA’ della CARICA e quindi la VELOCITA’ di MIGRAZIONE, sfruttata nell’ELETTROFORESI per separare le proteine
Cosa è l’ELETTROFORESI delle SIEROPROTEINE e come funziona?
L’ELETTROFORESI delle SIEROPROTEINE è una TECNICA di SEPARAZIONE che funziona nel seguente modo:
1) SIERO viene posto in un CAMPO ELETTRICO dopo essere stato diluito in un TAMPONE specifico
2) Le proteine migrano su un SUPPORTO SOLIDO (es. gel di agarosio) in base al loro RAPPORTO CARICA/MASSA
–> Le proteine si distribuiscono in zone specifiche, formando BANDE caratteristiche:
- Albumina (60% delle proteine totali)
- α1-globuline
- α2-globuline
- β1-globuline
- β2-globuline
- γ-globuline
NB: nella banda gamma di solito sono POLICLONALI ed eterogenee (migrazione DIFFUSA) e quindi se ho una BANDA OMOGENEA potrebbe indicare una COMPONENTE MONOCLONALE (CM)
Cosa è una COMPONENTE MONOCLONALE (CM) e come si identifica nell’elettroforesi?
Una COMPONENTE MONOCLONALE (CM) è un gruppo di immunoglobuline IDENTICHE prodotte da un SINGOLO CLONE di PLASMACELLULE
–> PROLIFERAZIONE CLONALE ANOMALA, potenzialmente patologica
Nell’ELETTROFORESI (unica tecnica in grado di discriminarla):
- Una BANDA OMOGENEA e stretta, tipicamente nella zona delle γ-globuline
(non sempre!!) - Un PICCO ALTO e STRETTO nel TRACCIATO DENSITOMETRICO
–> suggerisce una condizione detta GAMMOPATIA MONOCLONALE
Quali sono le principali TECNICHE IMMUNO-ELETTROFORETICHE e come funzionano?
Le principali TECNICHE IMMUNO-EETTOFORETICHE sono:
1) IMMUNOFISSAZIONE (su gel d’agarosio)
–> dopo la separazione elettroforetica, si AGGIUNGONO ANTICORPI specifici (anti-IgG, IgA, IgM, catene leggere κ e λ)
- Gli anticorpi si legano e dopo lavaggio e colorazione, si analizza il pattern di bande
2) IMMUNOSOTTRAZIONE (su elettroforesi capillare)
–> campione PRE-INCUBATO con ANTICORPI CONIUGATI a una proteina ad ALTO PESO MOLECOLARE
- Gli IMMUNOCOMPLESSI migrano più LENTAMENTE e NON SONO RILEVATI nella finestra di lettura
–> Si CONFRONTO il TRACCIATO con uno normale
Quali sono i VANTAGGI e gli SVANTAGGI dell’IMMUNOFISSAZIONE rispetto all’immunosottrazione?
VANTAGGI e SVANTAGGI dell’IMMUNOFISSAZIONE rispetto all’immunosottrazione:
1) VANTAGGI - Immmunofissazione
- Più SENSIBILIE e SPECIFICA
- Rileva CM a basse concentrazioni
- Migliore VISUALIZZAZIONE delle BANDE
2) SVANTAGGI - Immmunofissazione
- Processo più LUNGO e laborioso
- Più DIFFICILE da INTERPRETARE
A) VANTAGGI - Immmunosottrazione
- Completamente AUTOMATIZZATA
- Risultati più RAPIDI (9 MINUTI contro alcune ore)
- MINORE VARIABILITA’ operatore-dipendente
B) SVANTAGGI - Immmunosottrazione
- Meno SENSIBILE
- Possibili risultati INCONCLUDENTI (casi complessi)
Quali sono i TIPI di COMPONENTI MONOCLONALI (CM) che possono essere identificati e quale è la loro importanza clinica?
I tipi di componenti monoclonali (CM) che possono essere identificati sono:
- Immunoglobulina COMPLETA (es. IgG, IgA, IgM)
- Solo CATENE LEGGERE (κ o λ)
- Solo CATENE PESANTI (più raro)
CLINICA:
- CM da catene LEGGERE LIBERE (Proteina di BENCE-JONES) ha una prognosi più SEVERA rispetto a Ig completa, se la troviamo nelle URINE è indicativa di DANNO RENALE
- Mieloma multiplo, macroglobulinemia di Waldenström, o amiloidosi
Cosa è la proteina di BENCE- JONES e come si rileva?
La proteina di BENCE-JONES sono CATENE LEGGERE LIBERE MONOCLONALI presenti nelle URINE
–> Prodotte in eccesso da PLASMACELLULE NEOPLASTICHE (es. MIELOMA MULTIPLO)
PARADOSSO BIOLOGICO –> le catene leggere sono SEMPRE prodotte in ECCESSO rispetto alle catene pesanti durante l’assemblaggio
RILEVAZIONE: si fa una ELETTROFORESI delle proteine urinarie in cui si trovano catene leggere:
- LIBERE (non legate a quelle pesanti)
- MONOCLONALI
–> Può causare DANNO RENALE a causa della PRECIPITAZIONE nei TUBULI renali
Come si QUANTIFICANO le componenti monoclonali (CM) e quali sono i LIMITI delle tecniche immunochimiche in FASE LIQUIDA?
La QUANTIFICAZIONE delle componenti monoclonali (CM) si effettua principalmente attraverso:
1) Quantificazione DENSITOMETRICA o SPETTROFOTOMETRICA sul TRACCIATO elettroforetico:
- Si evidenzia la BASE del PICCO della CM
- Si CALCOLA l’AREA SOTTESA come %
- Si MOLTIPLICA per la concentrazione delle PROTEINE TOTALI per ottenere la concentrazione in g/L della CM
2) Tecniche IMMUNOCHIMICHE in FASE LIQUIDA (es. nefelometria, turbidimetria):
- MENO ACCURATE per le CM –> utilizzate solo quando non è possibile quantificare la CM sul tracciato elettroforetico (es. CO-MIGRAZIONE con altre proteine)
LIMITI delle tecniche IMMUNOCHIMICHE in FASE LIQUIDA:
- NON distinguono monoclonali da POLICLONALI
- Mancanza di parallelismo tra l’ANALITA MONOCLONALE e il CALIBRATORE POLICLONALE
- Rischio di ECCESSO di ANTIGENE
- Possibile SOVRA o SOTTOSTIMA della CM
Cosa sono le GAMMOPATIE MONOCLONALI e come si classificano?
Le GAMMOPATIE MONOCLONALI sono un GRUPPO variegato di patologie caratterizzate dalla PROLIFERAZIONE INCONTROLLATA di uno o più CLONI PLASMACELLULARI
–> questi producono una componente monoclonale (CM)
CLASSIFICAZIONE (meccanismi fisiopatologici):
1) Forme MANIFESTE dovute alla PROLIFERAZIONE del CLONE NEOPLASTICO
2) Forme clinicamente MANIFESTE dovute agli effetti patologici delle CM (NB: bata anche CM piccola per dare effetti gravi)
3) Forme OCCULTE (60%):
- MGUS (Gammopatie monoclonali di incerto significato) –> possono evolvere verso le DISCRASIE MALIGNE
- Gammopatie monoclonali TRANSITORIE (reversibili e benigne, associate ad INFEZIONI)
Cosa è la CRIOGLOBULINEMIA e come si manifesta?
La CRIOGLOBULINEMIA
–> è la presenza nel SIERO di una o più IMMUNOGLOBULINE che in vitro PRECIPITANO in modo REVERSIBILE a temperature < 37°C
–> Es. precipitano e CRISTALLIZZANO nelle ESTREMITA’ del corpo dove le T sono inferiori e BLOCCARE i VASI di piccolo calibro causando:
- Sindrome di Raynaud
- Porpora
- Artralgie
NB: può essere causata anche da una PICCOLA CM (es. IgG-K) e quindi anche CLONI BENIGNI sarebbero da ERADICARE
DIAGNOSI :
- CONSERVARE il campione a 37°C!
- Poi 7 GIORNI in FRIGORIFERO per QUANTIFICARE le crioglobuline (a 37°C, le crioglobuline si dissolvono nuovamente)
Come si esegue e interpreta il TEST per le CATENE LEGGERE libere nel siero?
Il TEST per le CATENE LEGGERE LIBERE nel SIERO:
–> Utilizza ANTICORPI SPECIFICI prodotti in MONTONI IMMUNO-TOLLERIZZATI che riconoscono EPITOPI esposti solo sulle catene leggere LIBERE
INTERPRETAZIONE:
–> si valuta il RAPPORTO tra la catena LEGGERA libera COINVOLTA nella proliferazione e quella NON COINVOLTA
- Rapporto > 100 = MIELOMA MULTIPLO (anche se non abbiamo i sintomi CRAB)
VANTAGGI:
- Permette una DIAGNOSI PRECOCE di DISCRASIA plasmacellulare
- Utile nel MONITORAGGIO
LIMITAZIONI:
- Problemi di LINEARITA’ alle ALTE CONCENTARZIONI e quindi può necessitare di DILUIZIONI SERIALI per ottenere risultati accurati
Quali sono i principali CASI CLINICI presentati nella lezione e cosa ci insegnano?
I principali CASI CLINICI presentati nella lezione includono:
1) CASO CLINICO 1:
- Tracciato elettroforetico sembra normale
- Immunofissazione rivela CM IgA e Igλ
–> fondamentale fare IMMUNOFISSAZIONE per rilevare CM che CO-MIGRANO con altre proteine
2) CASO CLINICO 2:
- PICCO SOSPETTO in zona β1 all’elettroforesi
- Immunofissazione rivela TRANSFERRINA, non CM
–> NON TUTTI i PICCHI ANOMALI sono CM; importanza della conferma con tecniche immunologiche
3) CASO CLINICO 3:
- Evidente CM all’elettroforesi
- IMMUNOFISSAZIONE rivela IgG λ + catene λ libere
Importante identificare le catene leggere libere –> possono cambiare la PROGNOSI del paziente
4) IPOGAMMAGLOBULINEMIA
- Elettroforesi normale ma con IPOGAMMAGLOBULINEMIA
- IMMUNOFISSAZIONE ad alta risoluzione rivela IgAk + catene k libere
–> in caso di ipogammaglobulinemia, FARE APPROFONDIMENTI, perchè può mascherare una CM
Quali sono i principali aspetti dell’ALGORITMO DIAGNOSTICO per la ricerca di CM?
L’ALGORITMO DIAGNOSTICO per la ricerca di componenti monoclonali include:
1) ELETTROFORESI CAPILLARE
- se NON TROVA la CM –> Referto: “tracciato senza alterazioni monoclonali”
- Se c’è DUBBIO –> HR-AGE (Elettroforesi su gel d’agarosio ad alta risoluzione) + IMMUNOTYPING
- Se si RILEVA una CM –> NUOVA = tipizzazione diretta, se NOTA confronto con profilo CM precedente (IMMUNOTYPING solo se diverso)
- CASI COMPLESSI –> HR-IFE (immunofissazione ad alta risoluzione)
Quali sono le principali DIFFERENZE tra l’IMMUNOFISSZIONE e l’IMMUNOSOTTRAZIONE in termini di sensibilità e applicabilità?
Le principali DIFFERENZE tra immunofissazione e immunosottrazione sono:
1) SENSIBILITA’
- è > in ImmunoFISSAZIONE (Gold Standard)
- L’immunosottrazione si perde soprattutto quando ci sono CM basse
2) MECCANISMO
- IMMUNOFISSAZIONE –> aggiunge anticorpi al campione separato elettroforeticamente per vedere delle BANDE (e quantificare)
- IMMUNOSOTTRAZIONE –> crea IMMUNOCOMPLESSI per ELIMINARE delle proteine a scelta per poi confrontare con il tracciato normale
3) APPLICABILITA’
- IMMUNOFISSAZIONE –> per CM basse
- IMMUNOSOTTRAZIONE –> per screening RAPIDO
4) INTERPRETAZIONE
- IMMUNOFISSAZIONE –> richiede maggiore esperienza
- IMMUNOSOTTRAZIONE –> interpretazione più semplice, ma può dare risultati INCONCLUDENTI in casi complessi
